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タンパク質A-タンパク質Bの結合をHTRFにより測定するアッセイ系を構築するため、大腸菌発現系でGST標識タンパク質Aを発現、精製した。精製したタンパク質Aを各種バッファーに溶解させ、市販品のタンパク質Bと組合せ、HTRFでの反応条件を至適化し、HTSの実施を前提としたアッセイ系を確立した。

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タンパク質A-タンパク質Bの結合をHTRFにより測定するアッセイ系を用いて、7種類の化合物の結合活性に与える影響を評価した。

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アルコール代謝の関連酵素を用いて酵素活性を指標にした被験物質のスクリーニングを実施した。

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変形性関節症の関連酵素に対する阻害剤の評価 (IC50の算出) を行った。

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SDS-PAGEによる補体活性評価系を構築し、活性化阻害剤の評価 (IC50の算出) を行った。

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癌細胞株にレポータープラスミドを導入しプロモーターアッセイ系を構築した後、約300種の被験物質について、プロモーター活性への影響を評価した。

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ルシフェラーゼを発現するレポーター細胞を用いて、開発素材の細胞への効果を定量的に評価した。

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SELEXにより標的ペプチドを認識するアプタマーのスクリーニングを行い、次世代シークエンスにより塩基配列を決定した。

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癌細胞株に化合物を作用させ、通常培養条件下と低酸素培養条件下で細胞増殖を比較した。また、培養上清中の低分子化合物をHPLCにより測定した。

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増殖因子刺激によるヒト表皮角化細胞株のヒアルロン酸産生アッセイ系を確立するために、ELISAにより増殖因子量依存性を検討した。

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増殖因子刺激によるヒト表皮角化細胞株の細胞増殖アッセイ系を確立するために、WST-8により増殖因子量依存性を検討した。

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抗癌剤の候補化合物が、癌細胞株の翻訳開始因子の複合体形成に影響を与えるかを、プルダウンアッセイにより検討した。

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既に確立された酵素の化学発光反応系を用い、提供された化合物について、60種類の酵素を個別に1536-well plate上で反応させ、その化学発光をプレートリーダーにて測定した。測定データ (プレート 16枚分) を提出した。

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タンパク質A-核酸Bの相互作用をHTRFにより測定するアッセイ系を用いて、提供された40万種類の化合物 (1536-well plateに分注済み) の相互作用阻害能を検討するため、それらの存在下でHTRFの測定を行った。

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タンパク質A-核酸Bの相互作用をHTRFにより測定するアッセイ系で一次選抜された1600種類の阻害候補化合物について、阻害作用の濃度依存性を検討するため、各化合物が16段階の量で分注された1536-well plateを用いて、HTRFの測定を行った。

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提供いただいたファージ/大腸菌ライブラリー、抗原について (ライブラリーと抗原の組合せは9種類)、パンニングを5回行い、抗原に反応する抗体を発現するファージを濃縮した。濃縮過程での抗原への反応性をELISAを用いて評価するとともに、過程毎のライブラリーをプラスミドDNAとして調製した。

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1工数のFTE試験として、下記 ①～③ の内容を委託者のご要望に沿ったかたちで実施した。
① ファージディスプレイにおけるパンニングの実施と濃縮過程のライブラリーDNAの調製、② 細胞からの抗体遺伝子のクローニングとプラスミドベクターの構築、③ ハイブリドーマの培養上清からの抗体の簡易精製と純度確認

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哺乳類細胞において、シグナルAに応答する配列の制御下でヒト分泌性アルカリ性フォスファターゼ (SEAP) を発現させるプラスミドベクターを構築した。そのプラスミドを細胞へ導入し、安定導入された細胞を樹立した。樹立した細胞について、シグナルAを活性化させる刺激を与え、分泌されるSEAPの活性を蛍光測定により評価した。

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ある癌においては、タンパク質Dの発現と、Dの受容体である膜タンパク質Aの細胞膜への発現量が増加している。膜タンパク質Aの細胞膜上の発現量を定量する方法を確立するために、細胞膜上のタンパク質をビオチン化し、ビオチン化タンパク質をアビジンビーズによりプルダウンした。プルダウンされたビオチン化タンパク質中のAをウエスタンブロットにより検出し、膜タンパク質Aの細胞膜上の存在比を測定する方法を確立した。この解析を30種の癌細胞株について行った。また、タンパク質Dの発現も、これらの癌細胞株で検討した。

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膜タンパク質Aの発現を抑制するためのshRNAを発現するレンチウィルスを作製した。膜タンパク質Aが細胞膜に高発現あるいは低発現している細胞株それぞれ6種に、作製したレンチウィルスを感染させ、shRNAを発現する細胞を選択した。膜タンパク質Aのノックダウンが各癌細胞の増殖に与える影響を検討した。

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大腸癌あるいは肺癌由来の細胞株について、タンパク質Xのチロシンリン酸化レベルをウェスタンブロットで解析した。また、その遺伝子XをノックダウンするためにshRNA発現用レンチウイルスを作製した。遺伝子Xのノックダウンが各癌細胞株の足場非依存性増殖に与える影響を検討した。

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ある疾患の原因として、肺や肝臓における細胞死が考えられている。この細胞死の誘導に関わる遺伝子Xの発現を抑制する薬の開発を目的とした。①HEK293細胞を用い、qPCRおよびウエスタンブロットにより、siRNAやアンチセンスオリゴの配列を比較選択した。②肺や肝臓由来の細胞株や初代培養を用い、遺伝子Xの発現上昇が見られる細胞死誘導系を確立した。③②の系を用いて、①で選択したsiRNAやアンチセンスオリゴが、細胞死誘導に関連する機能を抑制できるか検討した。

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FLAGタグあるいはGST融合タンパク質6種について、哺乳類浮遊細胞1 Lスケールで発現させ、アフィニティー精製を行った。

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増殖因子刺激によるERKリン酸化を検出するアッセイ系を確立するために、AlphaLISAキットを用いて増殖因子量依存的リン酸化の検討を行った。

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増殖因子刺激による受容体チロシンキナーゼの二量体化を検出するアッセイ系を確立するために、化学発光検出キットを用いて増殖因子量依存性を検討した。

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増殖因子による遺伝子発現誘導を検出するアッセイ系を確立するために、レポーターアッセイにより増殖因子量依存性を検討した。

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幾つかの変異を含むタンパク質に既存医薬品を添加し、限外ろ過を利用して、未結合医薬品を回収し、HPLCで定量した。

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昆虫細胞発現系およびコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて2種類の組換えタンパク質を発現させた。ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによる精製後、ビオチン標識を行った。

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昆虫細胞発現系およびコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて複数のタグを付加した2種類の組換えタンパク質を調製した。両者のタンパク質間相互作用を、AlphaScreenにより検出した。

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アミノ酸点突然変異を導入した300種類のタンパク質をデザインし、変異体遺伝子ライブラリーを作製した。コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて96ウェルプレート上にタンパク質アレイを構築した。合成したタンパク質はニッケルアフィニティクロマトグラフィーにより精製した後、活性測定試験に用いた。

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