受託合成サービス

被験物質を培養細胞に添加した際の食欲関連因子の分泌促進効果を調べた。食欲関連因子はAlphaLISAにて測定した。同時に、被験物質を培養細胞に添加した際の細胞傷害性を測定した。

大腸菌発現系：元のプロトコールを改善して目的タンパク質の発現量を向上させるため、発現培養条件検討を実施し、そこで決定した条件に基づき、最終精製品として1 mgを取得するのに必要な3 Lスケールの発現培養および大量精製を実施した。その結果、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーのクロマトグラムが改善され、予定通りの収量で目的タンパク質を取得した。また、菌体破砕条件についても検討し、改善された同様の品質でさらに最終精製品の収量を向上させる方法も確立した。
昆虫細胞発現系：5種類のタンパク質について昆虫細胞発現系での発現培養条件検討を実施した。その結果、不溶性画分への局在が確認されたため、可溶化条件検討を実施した。また、2種類については発現培養と同時にビオチン化可能かどうかも検討し、ウェスタンブロット解析でビオチン化されていることを確認した。
SPR解析：精製した1種類のタンパク質について、2種類のリガンドを用いたビアコアによるSPR解析を実施した。

評価対象器具に対して親和性のあるペプチド配列をファージディスプレイ法により同定することを目的とした。11種類の評価対象器具それぞれに対して、ランダムなペプチド配列を含有/提示するファージライブラリーをインキュベートし、その後、洗浄することを繰り返し、親和性を示すペプチド配列を含有/提示するファージを選別した。そして、選別されたファージの配列解析を行い、親和性を示すペプチド配列を同定した。

お客様よりいただいたマイクロ流路チップに細胞懸濁液を流し、流路内に細胞が残留するかどうかを評価した。マイクロ流路は合計14枚使用した。細胞は蛍光標識し、流路内の細胞の蛍光像を顕微鏡で取得し、解析した。

指定された25種類のペプチドを自社合成した。また、特定の受容体シグナルをルシフェラーゼ活性量として評価可能なレポータ細胞でシグナル評価系を構築した。96-well plateに播種したレポータ細胞を用いて、その25種類のペプチドについて、多段階の濃度条件下で受容体アンタゴニスト活性を評価した。使用した評価系については、最終的な目的を考慮して、テクノプロ側からお客様に提案した。

指定化合物のサンプルを合成した。そして、その他の反応条件の検討を実施。

機能性高分子材料の研究開発の方向性の判断材料とするために、高分子材料に関する既存技術のベンチマーク調査を行った。市販材料、特許、論文を調査し、各技術の特徴について整理した。市販材料のカタログ値、特許や論文から収集した物性値については、マッピングを行った。

CRISPR/Cas9システムと開発中の遺伝子編集システム、それぞれを用いて、哺乳類細胞のHPRT1遺伝子を遺伝子編集（ノックアウト）した。それら細胞を用いて、HATアッセイを行い、変異体出現頻度から、CRISPR/Cas9システムと開発中のシステムとの遺伝子編集効率を比較した。

ヒト血液検体から各種キット等を用いて、特定の細胞種を分離したうえ、開発中の測定機器でそれらを測定し、データを取得した。FTEとして、委託者の要望に応じて、選別細胞種を臨機応変に変更しながら、継続的に実施した。

被験物質がブルーライトからの保護効果を有するかを検討するために、正常ヒト成人皮膚由来繊維芽細胞および正常ヒト成人表皮由来角化細胞を用いて、LED照射実験を行った。LED照射下で、被験物質が細胞増殖やサイトカイン産生に与える影響を検討した。

食品原材料から抽出した分離画分5種が保湿効果を示す可能性があるか検討するために、正常成人皮膚由来線維芽細胞のコラーゲン産生に与える影響を、培養上清を用いたELISAにより検討した。

がん免疫療法における有効成分を封入した微粒子製剤を調製し、得られた微粒子製剤について、各種分光学的手法 (UV-Visスペクトル測定、HPLC、DLS等) を用いて解析を行った。また、調製した微粒子製剤を培養細胞へ導入し、in vitro評価を行った。
FTEとして、委託者の要望に応じて、試験条件を臨機応変に変更しながら、継続的に実施した。

対象となるタンパク質について、その最適な保存条件の選定を目的に、各種緩衝液および添加物存在条件下での安定性をDSF（Differential Scanning Fluorimetry）の手法を用いて検証した。アッセイの第一段階として、pH、塩濃度、あるいは塩の種類などを変化させた96条件の緩衝液でタンパク質を希釈し、昇温に対する蛍光強度の変化に基づいて各条件下における変性温度(Tm)を決定した。第二段階として、Tmに基づき最も安定性に優れると判断された緩衝液1条件にタンパク質を希釈し、これに96条件の添加物を加えて、第一段階と同様にTmを決定した。試験の結果、4条件の添加物存在下において、緩衝液のみと比較してTmが上昇したことから、これらを保存条件候補として提案した。

特許を参考に、ポリマーA誘導体の合成方法の検討及び合成を行った。

政府や公的機関の発行する白書、報告書、研究開発戦略、論文や特許といった技術文献、各企業の研究開発動向等の公開情報を調査した。高分子材料の現在の課題、将来ニーズを整理して、研究開発のターゲットとする用途を提案した。

委託者が開発中の臨床検査機器を搬入・設置し、SOPを整備したうえ、人工血液を使用して海外申請用データを取得した。

抗体医薬の開発において、発現ベクター、発現方法および精製方法の改良を行い不安定な構造の目的タンパクの精製に成功した。原料(培養上清)には凝集体を含む雑多な夾雑タンパク質が含まれていることが観察され、この除去をゲルろ過で行うことを提案されていた。しかし、ゲルろ過工程では想定以上の原料が必要となり、また、提出する精製抗体の濃度が低くなること、さらには実際のゲルろ過工程で目的タンパクの分解が観察され目的タンパク質の提出は出来なかった。そこで、目的タンパク質である4量体の新たな精製方法を検討した。その結果、アフィニティ精製時の使用カラムおよび溶出条件、その後の凝集体分解処理方法の開発、透析による夾雑タンパク質の除去方法の開発に成功し、高濃度の精製タンパク質を提出できた。また本組換え抗体は大変不安定であることが判明し、構造の改良を行うことを提案した。

ある種のキノコから水溶性多糖類を抽出し、各種クロマトグラム及び沈殿法を用いて目的多糖類を精製した。精製した多糖類にある官能基を有機合成的手法で導入した。

ヒトiPSCニューロンに被験物質を作用させ微小電極アレイMEAにより細胞外活動電位の変化を測定した。多種の神経作動物質を対照として人工知能ＡＩ及び多変量解析により、中枢神経毒性におけるプロファイルを評価した。また、人工知能AIにより標的イオンチャネル/受容体の推定を実施した。

７種類の基材に対してペルオキシダーゼ標識抗体を用いたタンパク質吸着試験を実施した。1cm角に裁断された各基材を24-well plateの各ellに1枚ずつ入れ抗体液に浸漬した。浸漬時間を4種類設け、各浸漬時間におけるタンパク質吸着量を測定した。

指定のレシピで無機有機ハイブリッドコート剤のラボスケール合成を2バッチ実施した。

豊富な表面処理加工技術の知見をもとに、高分子材料の表面処理に関する技術相談に応じた。毎週１回のミーティングでは、簡易な技術調査を踏まえて材料やプロセスを提案し、委託者での実験結果に対する提言を行った。

複合体を形成するヒト由来のタンパク質3種類を大腸菌において発現させるベクタープラスミドを構築した。それらを大腸菌に導入し、ヘテロ三量体として共発現させた。ニッケルアフィニティ精製、陰イオン交換カラム精製、ゲルろ過クロマトグラフィーを行い、シングルピークの高純度三量体タンパク質を精製した。

測定機器の性能評価を目的として、試験委託者より提供いただいたヒト検体を指定の測定機器で測定し、データを収集した。また、手作業でのデータ測定、フローサイトメトリーでのマーカー測定・解析を実施し、結果を提出した。

3種類の種属特異的に検出し、それ以外の 10種類以上の種属を検出しないような Real-time PCR probe を設計した。作成したprobe と primer、template DNAを用いてReal-time PCR (qPCR) を実施し、目的の3種属のみが検出されることを確認した。

マウス間葉系幹細胞(mMSC)へのセンダイウイルス感染により6種類のヒトタンパク質遺伝子を発現させ、その発現を確認することを目的とした。
センダイウイルスは試験委託者からご提供頂き、mMSCの培養、ウイルス感染、発現解析を実施した。
まず、24 well plateで培養したmMSCにEYFP発現用コントロールセンダイウイルスをMOI=3および10で感染させ、感染条件の検討を実施した。細胞をウイルスフリー化し、核をHoechstで染色し、共焦点イメージサイトメーター CQ1によりEYFPの発現を指標に感染効率を解析した。また、増殖速度についても測定した。
次に、6種類の目的遺伝子を発現させるためのセンダイウイルスをmMSCに感染させ、薬剤選択後、発現させたタンパク質に対する抗体を用いて、CQ1およびフローサイトメーターにより発現解析を行い、細胞膜や細胞内に発現していることを確認した。

果実種子抽出物のある特定成分を逆相HPLCを用いて定量した。また当該成分を別の化学分析に供するため、98％以上で精製した。

3種類のタンパク質複合体および1種類のFab抗体について、先の試験（結晶化条件検討および結晶化調製）で取得した良質な結晶を用いて、SPring-8によりX線回折強度データを収集し、解析した。初期位相はPDBおよびAlphaFold2の予測構造から決定し、解析データより構造精密化を実施した。取得した構造モデルを評価し、納品した。

市販品から類縁化合物を推測し、合成ルート探索及び、合成を実施した。

植物性由来の機能性タンパク質の抽出・精製法や機能性評価方法に関する情報について文献・特許を調査し、提供した。

細胞Aの増殖活性を指標にした被験物質Iの生理活性評価系の構築を行った。細胞の播種数、被験物質の添加濃度、培養期間の検討を行い、それぞれについての至適条件を決定した。また、細胞Bの酵素活性を指標にした被験物質IIの生理活性評価系の構築を行った。細胞の播種数、被験物質の添加濃度、培養期間の検討を行い、それぞれについての至適条件を決定した。

タンパク質A-タンパク質Bの結合をHTRFにより測定するアッセイ系を構築するため、大腸菌発現系でGST標識タンパク質Aを発現、精製した。精製したタンパク質Aを各種バッファーに溶解させ、市販品のタンパク質Bと組合せ、HTRFでの反応条件を至適化し、HTSの実施を前提としたアッセイ系を確立した。

キノコを熱水抽出して、水溶性β-グルカンを精製した。得られたβ-グルカンに有機合成の手法でリン酸基を導入し、リン酸導入量を算出して提出した。

デバイスに固相化する予定のタンパク質2種類について、温度条件を振って14日間の保存を行った。保存過程における各タンパク質の経時的な活性低下をELISA及び既知の酵素活性測定系によって追跡した。試験に用いる温度条件は、24時間の先行試験を参考とし、Arrhenius plotによって決定した。

製造メーカーの異なる生体高分子分析カラムの互換性を検証した。
基準物質を用いて分離能の差を検証した後、生体高分子の検体を分析と同時に分画し、カラム間での差異を評価した。また、分画サンプルは、分光学的手法により溶出量を算出し、カラム間での吸着量の差を比較した。

化学反応の制御に対する委託者指定の機器の効果を検証することを目的とし、新しい反応系の構築の為の調査・実験・検討を行った。

機能性表示食品の届出に必要とされる、目的の機能性成分の臨床試験に関する文献を調査した。

プロモーター、転写促進因子を各種組合わせ、魚類細胞において目的タンパク質を発現するプラスミドベクターを9種類、設計・作製し、提出した。

タンパク質A-核酸Bの相互作用をHTRFにより測定するアッセイ系で一次選抜された1600種類の阻害候補化合物について、阻害作用の濃度依存性を検討するため、各化合物が16段階の量で分注された1536-well plateを用いて、HTRFの測定を行った。

提供いただいたファージ/大腸菌ライブラリー、抗原について (ライブラリーと抗原の組合せは9種類)、パンニングを5回行い、抗原に反応する抗体を発現するファージを濃縮した。濃縮過程での抗原への反応性をELISAを用いて評価するとともに、過程毎のライブラリーをプラスミドDNAとして調製した。

His-tag標識されたタンパク質Aと細胞抽出液を混合後、ニッケル・セファロースビーズでタンパク質Aをプルダウンした。プルダウン後のビーズ抽出液について、SDS-PAGEを行い、タンパク質Aと相互作用すると考えられるタンパク質Bおよびタンパク質Cに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行い、タンパク質A、B、Cの物理的相互作用を解析した。

1工数のFTE試験として、下記 ①～③ の内容を委託者のご要望に沿ったかたちで実施した。
① ファージディスプレイにおけるパンニングの実施と濃縮過程のライブラリーDNAの調製、② 細胞からの抗体遺伝子のクローニングとプラスミドベクターの構築、③ ハイブリドーマの培養上清からの抗体の簡易精製と純度確認

出芽酵母内でDNA断片をつなぎ合わせ、感染力を欠失させたウイルスのゲノム (>20kb) をプラスミドとして構築した (ウイルスベクタープラスミド)。その後、酵母からDNAを抽出し、それを元に大腸菌を形質転換させ、ウイルスベクタープラスミドを抽出、精製した。

提供されたラット細胞のRNA (cDNA) から、Immunoglobulin heavy chain および light chain の variable region をPCR増幅し、それぞれの variable region の配列を同定した。

正常ヒト新生児表皮角化細胞に対して、被験物質存在下で過酸化水素を添加し、培地交換後、DCFDA/H2DCFDA-Cellular ROS Assay Kitを用いて、過酸化水素の細胞透過度を評価した。

正常ヒト新生児表皮角化細胞に対して、被験物質存在下で紫外線 (UVB) を照射し、産生されるプロスタグランジンE2 (PGE2) の量をELISAを用いて評価した。

提供いただいた9種類の培養器具のそれぞれについて、タンパク質吸着試験、エンドトキシン試験、細胞接着試験を実施した。

プローブ 4 種類、陽性対照プローブ 1 種類を調製し、ゲノム DNA 1 検体を対象としたサザンブロット解析を実施し、4 種類のプローブによる検出の可否を評価した。プローブ 2 種類については、ゲノム DNA 中に対応配列がないため、それぞれ対応するプラスミドをゲノム DNA に混合することにより、プラスミド由来のシグナルを検出した。

哺乳類細胞において、シグナルAに応答する配列の制御下でヒト分泌性アルカリ性フォスファターゼ (SEAP) を発現させるプラスミドベクターを構築した。そのプラスミドを細胞へ導入し、安定導入された細胞を樹立した。樹立した細胞について、シグナルAを活性化させる刺激を与え、分泌されるSEAPの活性を蛍光測定により評価した。

ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）において、タンパク質Aおよびその受容体のmRNA発現をqPCRで確認し、老化モデルでの変動と化粧品原料のスクリーニングを実施した。まず通常モデルでタンパク質Aとその受容体のmRNA発現を確認したところ、タンパク質Aは低発現ながら評価可能であり、受容体は十分な発現が認められた。次にH₂O₂（過酸化水素）処理で作製した老化モデルの特性を確認し、受容体のmRNAは通常モデルより低下した一方、タンパク質Aは群間で大きな差を示さなかった。スクリーニングでは原料10種（1% v/v）を添加し、細胞毒性を回避しつつ評価した。その結果、受容体の発現誘導は認められなかったが、タンパク質Aは複数原料で増加し、特にサンプル5が老化モデルで最も強く発現を誘導した。本試験は、老化環境下でのタンパク質Aの発現を指標とした原料選抜の有効性を示した。

マウスの大脳皮質から神経細胞およびアストロサイトを単離、共培養した。被験物質添加後の各種代謝量を測定し、代謝評価系として機能することを確認した。

SELEXにより標的ペプチドを認識するアプタマーのスクリーニングを行い、次世代シークエンスにより塩基配列を決定した。

ある癌においては、タンパク質Dの発現と、Dの受容体である膜タンパク質Aの細胞膜への発現量が増加している。膜タンパク質Aの細胞膜上の発現量を定量する方法を確立するために、細胞膜上のタンパク質をビオチン化し、ビオチン化タンパク質をアビジンビーズによりプルダウンした。プルダウンされたビオチン化タンパク質中のAをウエスタンブロットにより検出し、膜タンパク質Aの細胞膜上の存在比を測定する方法を確立した。この解析を30種の癌細胞株について行った。また、タンパク質Dの発現も、これらの癌細胞株で検討した。

膜タンパク質Aの発現を抑制するためのshRNAを発現するレンチウィルスを作製した。膜タンパク質Aが細胞膜に高発現あるいは低発現している細胞株それぞれ6種に、作製したレンチウィルスを感染させ、shRNAを発現する細胞を選択した。膜タンパク質Aのノックダウンが各癌細胞の増殖に与える影響を検討した。

大腸癌あるいは肺癌由来の細胞株について、タンパク質Xのチロシンリン酸化レベルをウェスタンブロットで解析した。また、その遺伝子XをノックダウンするためにshRNA発現用レンチウイルスを作製した。遺伝子Xのノックダウンが各癌細胞株の足場非依存性増殖に与える影響を検討した。

被験物質が筋肉の発達・成長に及ぼす効果を検討するために、C2C12細胞の分化におけるミトコンドリア量の変化に与える影響を検討した。

ある疾患の原因として、肺や肝臓における細胞死が考えられている。この細胞死の誘導に関わる遺伝子Xの発現を抑制する薬の開発を目的とした。①HEK293細胞を用い、qPCRおよびウエスタンブロットにより、siRNAやアンチセンスオリゴの配列を比較選択した。②肺や肝臓由来の細胞株や初代培養を用い、遺伝子Xの発現上昇が見られる細胞死誘導系を確立した。③②の系を用いて、①で選択したsiRNAやアンチセンスオリゴが、細胞死誘導に関連する機能を抑制できるか検討した。

化合物がヒト酵素の翻訳後修飾に与える影響を検討するために、FLAGタグ融合タンパク質を哺乳類浮遊細胞で発現させ、アフィニティー精製後、SDS-PAGEにより分離し、目的タンパク質のバンドを切り出し提出した。

食品原材料から抽出した分離画分5種が血管機能改善効果を示す可能性があるか検討するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞のNO産生に与える影響を、Griess試薬を用いて測定した。

提供いただいた開発中の細胞培養関連製品を用いて細胞を培養し、細胞増殖をWST assayで測定し、細胞毒性を評価した。

牛乳を用いて果実由来成分のタンパク質凝集作用の濃度依存性を評価した。合わせて、牛乳添加が該当成分の生理活性に与える影響を評価した。

受容体をアミンカップリングによってセンサーチップ表面に固相化後、各種リガンドとの相互作用を解析し、会合速度定数ka、解離速度定数kdを算出した。

委託者の開発品であるポリマーとタンパク質を複合化させ、複合化率及び複合化条件下でのタンパク質の安定性を分析した。

293系細胞にFab抗体重鎖および軽鎖発現ベクターを構築後、細胞へ一過性導入し、培養上清に分泌された組換えFab抗体の発現を検討した。発現した組み換えFab抗体はアフィニティクロマトグラフィーにより精製精製した。

コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いてリポソーム存在下でGPCRを合成した。リポソームに埋め込まれたGPCRを遠心により粗精製した後、界面活性剤によりGPCRを可溶化した。委託者の立会いのもとで試験を行うことで技術移管を実施した。

緑藻に含まれる特定の糖脂質を精製した。有機溶媒による抽出後、クロロフィル等の夾雑物を数工程のクロマトグラフィー処理により粗精製した後、逆相HPLCカラムで特定の脂質鎖を有する糖脂質１成分を純度95％以上で精製した。

特定の細胞に分化した場合に培養液中にマーカータンパク質を分泌するヒト間葉系幹細胞 (MSC) の調製を行った。細胞種特異的な活性を持つプロモーターと分泌型アルカリ性フォスファターゼのユニットを持つレンチウイルスを調製した。それをMSCへと感染させた後、薬剤選択により、ウイルス感染細胞を単離した。

目的タンパク質の分子結合ドメインとそのアミノ酸変異体300種類をコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて調製した。Hisタグと蛍光タンパク質を付加して合成した組換えタンパク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィにより精製し、標的分子との結合機能を評価した。

ヒトiPSCニューロンに被験物質及び陽性/陰性対照化合物を作用させ、得られたデータを元に人工知能ＡＩで解析することで、中枢毒性や神経機能のフェノタイプを評価

ヒトiPSCニューロンに被験物質及び陽性/陰性対照化合物を作用させて得られたデータを人工知能ＡＩで解析し、中枢毒性のプロファイルを評価した。また、既に取得している動物試験結果との相関性を検証した。

8種類の細胞培養基材をN=3で用意し、基材存在下で線維芽細胞を24-well plateを用いて1日~2週間培養した。培養後、MTTアッセイを行い、基材に細胞が接着しているかどうかを評価した。

C末端Hisタグ融合蛍光タンパク質、およびそのタンパク質のN末端にあるタンパク質のドメインを融合させたタンパク質それぞれについてコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系によりタンパク質合成を行った。合成タンパク質はNi-NTAアフィニティー精製を行った後、試験委託者指定の濃度に濃縮した。数mgの目的タンパク質を調製し、試験委託者に提出した。

微小電極アレイ（MEA、Micro Electrode Array）上で齧歯類大脳皮質細胞およびヒトiPS細胞由来ニューロンを培養し、様々な被験物質の神経活動への影響を高感度に測定した。イオンチャネル、神経受容体、GPCRに作用する化合物を陽性対照として使用し、急性期及び慢性期毒性を想定したデータ取得した。そして、記録された活動電位データを最新の人工知能（AI）技術で詳細に解析した。この先進的アプローチにより、被験物質の正確な作用点特定と神経機能への影響評価を実現した。

提供いただいた4種類の凍結細胞サンプルについて、3種類の間葉系幹細胞マーカー (CD29、CD73、CD90) の発現をフローサイトメーターにより解析した。陽性対照として、テクノプロでそれらの発現を確認していたヒト間葉系幹細胞を使用した。4種類全ての検体において、CD29陽性/CD73陽性/CD90陽性の細胞を高い割合で含有することを明らかにした。

ヒトiPS細胞由来神経細胞（iPSCニューロン）に被験物質及び対照化合物を作用させて得られた神経活動データを、多変量解析及び人工知能AIで解析し、中枢神経毒性のプロファイルを評価した。まず、MEA (Microelectrode Array) プレート上でiPSCニューロンを培養し、ネットワークバーストの細胞外電位を測定した。更に、測定データから算出された電気学的パラメータを用いた多変量解析により、被験物質がパラメータに与える影響を検討し、被験物質のけいれん誘発ポテンシャル評価及び作用機序の推定を行った。人工知能AI解析では、対照化合物の神経活動ラスタープロットから画像認識により特徴量を特定しパターン認識を行い、アルゴリズムを積層して学習AIを作製した。学習AIに被験物質データを適応させて、毒性予測及び作用機序予測を実施した。

疾患原因遺伝子に変異を有するヒトiPSCニューロンを用いて、被験物質の薬効評価系を構築した。細胞を培養して原因遺伝子、神経マーカー、それらの遺伝子等の発現を経時的に解析した。更に神経ネットワークにおける活動電位の変化を多変量解析により検討し、試験系を最適化した。

前試験においてヒトiPSCニューロン疾患モデルのin vitro評価系を構築した後、本試験として、神経ネットワークにおける活動電位の神経機能を指標にして、被験物質の薬効を評価した。疾患iPSCニューロンモデル、及び健常なニューロンの神経機能を比較し、被験物質が疾患の状態を健常状態へ改善する効果を多変量解析及び人工知能AIを用いて評価した。

遺伝子編集によりターゲット遺伝子の発現が減少している神経疾患モデルのiPSCニューロン（変異株）を用いてMicroelectrode Array計測、及び電気生理学的パラメーターを基にした多変量解析により神経活動を確認し、遺伝子発現や神経マーカー発現の検討も含め、変異株の特徴を検証した。次に変異株を用いて被験物質（核酸化合物）の薬効として、ターゲット遺伝子の発現を正常化する作用、及びシナプス機能の改善作用を評価した。

目的タンパク質を発現させた哺乳類細胞ペレットから超遠心により粗膜画分を調製した。粗膜画分から界面活性剤を用いて目的膜タンパク質の可溶化を行い、超遠心により可溶性画分を調製した。可溶性画分にアフィニティ精製を行い、最終的に200mLスケールの発現細胞ペレットから0.2mg分の細胞膜タンパク質を調製した。

数種類の膜タンパク質をコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系により合成した。合成は透析重層法 (2.5 mL)で各1反応ずつ実施した。
合成膜タンパク質はプロテオリポソーム調製を行った後、界面活性剤を用いて可溶化させた。可溶化後の遠心上清を用いてタグアフィニティー精製を行い、ゲル濾過クロマトグラフィーで所定のバッファーに置換した。

試験委託者提供のヒトiPS細胞に対して、EF-１αプロモーター制御下で蛍光タンパク質を発現する発現カセットをAAVS1 safe harborへ導入した。iPS細胞の薬剤選択濃度の検討、発現ベクターの構築、iPS細胞への遺伝子導入方法の検討（lipofection、electroporation）、iPS細胞への目的遺伝子の導入、蛍光観察およびPCRによる目的遺伝子座への発現カセットの導入確認を実施した。

特定のプロモーター配列に蛍光タンパク質を接続した発現カセット (プラスミド) を作成し、その後、HEK293細胞でプロモーター活性（蛍光タンパク質の発現）を確認した。その発現カセットをヒトiPS細胞中のAAVSAAVS1 safe harborへ導入し、薬剤選択後、PCRにより目的領域への発現カセットの導入を確認した。

ヒトiPS細胞から分化誘導した腸管上皮細胞をトランズウェルインサート上で培養し、バリア能を経上皮電気抵抗（TEER）値測定により評価し試験に用いた。バリア能を有している状態の細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットにより腸管膜透過に関わる遺伝子が発現していることを確認した。透過性試験は、検体をapical面もしくはbasolateral面にそれぞれ2濃度ずつN=3で添加した。検体添加24時間後および48時間後のapical側およびbasolateral側の培地を回収し、ELISA法にて培地中の検体濃度を測定した。測定データからPapp値を算出し、報告書にまとめて提出した。

ヒトiPSC由来ドーパミンニューロンを培養し、薬物依存性を示す化合物、非依存性の化合物、そして試験化合物を暴露した。その際、化合物の濃度を変えて暴露し、神経ネットワークでの細胞外活動電位を計測・記録した。培地を交換して時間を置いた後、更に化合物を暴露して活動電位を記録した。計測した活動電位の変化を統計学的な多変量解析及び人工知能AIを用いて評価することで、ドーパミンニューロンの被験化合物に対する依存性を評価した。

培養したヒトiPS細胞由来感覚ニューロン及び神経活性化物質を用いてin vitroの鎮痛試験モデル系を作製した。感覚に関連する分子やTRPファミリー受容体に対する阻害物質（陽性対照）及び試験化合物をモデル系に作用させMicroelectrode array (MEA)計測装置によりニューロンの細胞外活動電位を記録した。記録データを統計学的多変量解析及び人工知能AIを用いた解析により分析することで、試験化合物の感覚に対する薬効を評価した。ニューロンよりRNAを抽出してqPCRを行い、標的とする感覚関連分子、イオンチャンネル、受容体の遺伝子発現を検討した。

陽性対照 マイクロRNA (miRNA) を用いて試験系に問題がないことを確認後、被験物質で処理した検体よりエクソソーム(細胞外小胞(EV)) を分離してRNA を調製し、特定の EV miRNA をリアルタイム PCR (qPCR) によって解析した。結果として得られた Ct 値を被験物質未処理の陰性対照検体と比較することで、EV miRNA の増加 (被験物質による EV 産生量の亢進) の傾向を明らかにした。

2種のタンパク質から成る複合体をゲルろ過クロマトグラフィー精製し、結晶化用試料を調製した。動的光散乱法(DLS)により均一性を評価し、結晶化に適した品質であることを確認した。

結晶化に適した高純度な試料調製を目的とし、お客様からご提供いただいた遺伝子情報を基に発現プラスミドベクターを作製した。そして、大腸菌発現系を用いて組換えヘム含有タンパク質の発現条件検討、Ni-カラムを用いた小スケール精製を実施した。

N末端に2種類のタグを付加したタンパク質を発現するプラスミドベクターを構築し、大腸菌発現系を用いて発現条件を検討し最適化した。不溶性画分として得られた目的タンパク質を可溶化し、IMACを用いて粗精製後、段階透析法によりリフォールディングを実施した。リフォールディング後の試料はビオチン化し、酵素反応で切断処理あるいは未処理の両試料についてゲルろ過クロマトグラフィー精製し、高純度試料を取得した。

お客様より提供いただいた動物組織の冷凍品から内在性の膜タンパク質複合体をタグフリーで精製した。動物組織はポリトロンを用いて破砕した。破砕液から高速遠心および超遠心により膜画分を分離し、界面活性剤を用いて可溶化した。可溶化された試料をアフィニティカラムを用いて精製し、高純度の膜タンパク質複合体を取得した。

3次元皮膚モデルを使用し、被験物質の添加について5条件、UV照射について3条件の計15条件においてメラニン産生量を比較検討した。

ピキア酵母 (Pichia pastoris) 発現系において、12種の異なる分泌シグナル配列をターゲットタンパク質に付加し、ターゲットタンパク質が最も分泌される分泌シグナル配列をスクリーニングした。最適な分泌シグナル配列を持つ発現株を1 Lスケール培養し、ターゲットタンパク質を取得した。

ピキア酵母 (Pichia pastoris) 発現系を用いて、異種タンパク質を分泌発現させた。Mut+株およびMutS株についてそれぞれ高発現クローンを選定した。Mut+株およびMutS株を培地4種で小スケール培養し、標的タンパク質の発現に適した培地および培養日数を決定した。標的タンパク質発現に適したMut表現型の高発現クローンを最適条件 (培地、培養日数) で、1 Lスケール培養し、標的タンパク質を含む培養上清を取得した。

ピキア酵母 (Pichia pastoris) 発現系を用いて酵素3種を分泌発現させた。小スケール培養によりターゲット高分泌株を選定し、Mut表現型2種、発現誘導培地3種、誘導培養日数を検討してターゲットタンパク質の分泌量が最大となる最適誘導条件を決定した。最適誘導条件下でスケールアップ培養を実施し、IMAC精製により、各培養上清から高純度のターゲット酵素を調製した。

ピキア酵母 (Pichia pastoris) 発現系を用いてヒト由来タンパク質２種の融合タンパク質を分泌発現させ、ウエスタンブロッティングにより発現確認を実施した。高発現株について発現誘導後の培養時間を検討し、発現誘導最適条件を決定した。

A⇄Bの反応を触媒する酵素の変異体（18種類）について、A⇄Bの反応に加えてC⇄Dの反応やE⇄Fの反応を触媒するかどうかを評価した。18種類の変異体を大腸菌発現系を用いて発現させ、IMACによる精製後に酵素反応を行い、反応物をHPLCにて定性的に測定することで各変異体についての触媒反応を評価した。

化粧品原料11種類の皮脂分泌促進または抑制効果を評価するため、ハムスター由来培養皮脂腺細胞に被験物質を添加し、1細胞当たりの脂肪滴生成量を解析した。

10種類の被験物質について毛乳頭細胞の活性に与える影響を調べるため、FGF7、VEGF-Aなどの分泌因子について遺伝子発現量（qPCR）およびタンパク質発現量（ELISA）を比較検討した。

iPS由来神経細胞を96ウェルプレートで培養後、標的遺伝子をノックダウン (siRNA 導入)、または過剰発現 (Vector 導入) し、その7日後に以下の解析を実施することでその影響を評価した。
１．RNA抽出し、標的遺伝子(4種)をリアルタイムPCR (qPCR) で定量的に評価した。
２．細胞を固定し、免疫蛍光染色(３重染色)でタンパク質の局在・発現変動を評価した。
３．培養上清を回収し、特定因子の濃度を酵素活性により定量的に評価した。

調製した結晶化用タンパク質試料を用いて、結晶化条件の初期スクリーニングを行った。動的光散乱法（DLS）によって単分散と判断された画分を集めて濃縮し、その後、二次スクリーニングを行うことで結晶構造解析に適した良質な結晶を得た。得られた結晶を用いて最適な抗凍結剤について確認し、放射光でのX線回折強度データ収集に向けた結晶の調製を行った。

Apoptosis Assay kitを使用し、384-well plate上で細胞2種、化合物2種、濃度９点（０を含む）の条件を組合わせ、400 pointのアポトーシスおよびネクローシスの評価を実施した。予備検討により使用細胞数を増加させたほうが良いことが判明したため、本検討では細胞数を増加させることで、被験物質による指定細胞のアポトーシスおよびネクローシスについて適切に評価することができた。

被験物質を摂取させたショウジョウバエ (各群16匹) の活動量をDAMシステムを用いて経時的に測定し、コントロール群と比較することにより、被験物質2種類の概日リズム (サーカディアンリズム) に与える影響を評価した。

ヒト糞便検体（48検体）からDNAを抽出・精製し、それを鋳型として、5種類の腸内細菌をぞれぞれ絶対定量するqPCR (Real-time PCR) を行った。

ご提供いただいた遺伝子情報に基づき、酵母2種属の3種類の目的遺伝子について、目的遺伝子-蛍光タンパク質遺伝子-薬剤耐性遺伝子のプラスミドベクター（計6種類）を設計した。各プラスミドベクターの3つの合成遺伝子を3段階で基本ベクターに挿入し、シーケンスにより塩基配列に間違いがないことを確認した。構築したプラスミドベクターを大腸菌より抽出・精製し、納品した。

リピート配列で構成された目的DNA配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌を16 Lスケールで培養し、プラスミドを大量調製した。調製したプラスミドを制限酵素により切断し、PEG沈殿および陰イオン交換クロマトグラフィーにより目的DNA断片 (約200 bp)を精製した。最終的に10 mg以上の高純度の目的DNA 断片 (約200 bp) を取得した。

試験委託者ご提供のタンパク質および7種類のPEGについて、アミンカップリングまたはチオールカップリングを用いて、タンパク質のN末あるいは特定のCys残基へPEGが付加する条件を検討した。付加条件が決定されたPEGについては、スケールアップしてPEG化タンパク質を調製し、納品した。

遺伝子編集により、運動機能に障害が起きる神経変性疾患のモデルとなる変異ヒトiPSCニューロンを作製した。作製した変異ニューロンにおいて、標的遺伝子が発現していることをqPCRにより確認した。Microelectrode array (MEA) 計測装置によるニューロンの細胞外活動電位測定により、ニューロンからの安定的な自発発火が認められる時期を検討した。変異ニューロン、isogenicニューロンの両者において、3種の被験物質を作用させた数日後に神経の活動電位を計測し、統計学的な多変量解析および人工知能AIを用いた比較解析を行い、被験物質の神経機能修復作用を評価した。

16種類の被験物質（陰性コントロールおよび陽性コントロールを含む）がヒト歯肉上皮細胞の活性酸素種 (ROS, Reactive oxygen species) および炎症性サイトカイン (TNF-α、IL-6、IL-8) の産生に与える影響を評価した。まず、細胞毒性試験により適切な被験物質の作用濃度を検討した。そして、検討で決定した濃度で被験物質を作用させ、細胞内の活性酸素種量および培養上清中の炎症性サイトカイン量をELISA等により測定した。

複数株のFLU AおよびFLU BをMDCK細胞に感染させ、HA試験によりウイルス増殖と感染性を評価した。細胞変性とHA価の推移から、ウイルス増殖系の確立を確認した。

ピキア酵母3種について、カルタヘナ法令に基づく遺伝子組換え生物の産業第二種使用等拡散防止措置確認申請書を作成した。

7種類の酵素について、大腸菌あるいは酵母（Saccharomyces cerevisiaeまたはKluyveromyces lactis）発現系を用いて発現検討した。その結果、ほとんどの酵素が不溶化していたため、これらの酵素については、大腸菌あるいは酵母発現系とは別の発現系を用いたほうが良いことが判明した。

委託者から提供されたタンパク質について、タンパク質の熱安定性を評価し、最適なバッファー条件を探索することを目的としてバッファー条件を検討した。8条件のpH、5種類の緩衝液、6種類の添加剤を組み合わせた96種類の溶媒条件下におけるThermal Shift Assay（TSA）により、変性温度（Tm）を測定し、タンパク質の安定性の高いバッファー条件を特定した。

予備検討としてHis-tagを付与した酵素5種の野生型について大腸菌発現系による発現条件検討を実施し、各酵素の発現条件を決定した。決定した条件で発現させた各酵素を金属キレートカラムクロマトグラフィー（Ni-NTA）により精製後、培養液1Lあたりの精製タンパク質量を算出し、ハイスループットスクリーニングに必要な培養液量を確認した。各酵素の精製タンパク質を用いて活性測定系を構築して検証したところ、4種類の酵素について活性測定系が機能していると判断された。発現精製した各酵素のホモログについて、それぞれ構築した活性測定系を用いてスクリーニングし、求める酵素活性を持つホモログを決定した。

3 Lの細胞培養上清について、透析によりバッファー交換後、AKTAを用いた金属キレートカラムクロマトグラフィー(Ni-NTA)によりHisタグ融合タンパク質をアフィニティー精製した。溶出画分をSDS-PAGEにより解析し、目的タンパク質画分をまとめて濃縮後、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（SEC）により精製した。溶出画分をSDS-PAGEにより解析し、目的タンパク質画分を指定の濃度となるよう濃縮後に凍結し、納品した。

１．タンパク質収量改善検討
委託者で実施している大腸菌発現系を用いたタンパク質発現精製において、収量が0.4 mg/L程度であったため、まずは収量改善のためのプロトコールの検討を実施した。その結果、約100 mg/Lの収量で安定して発現精製可能となった。
２．タンパク質の大量調製
前臨床試験に使用するため、１で確立したプロトコールによりタンパク質の大量調製を実施し、各ロットごとにエンドトキシン濃度を測定した。ロット数の増加によりエンドトキシン濃度が高くなる傾向が確認されたため、規定のエンドトキシン濃度以内に収まるようにプロトコールを改良した。
３．タンパク質性状の確認
タンパク質の性状について疑問が生じたため、Thermal Shift Assay（TSA）による熱安定性試験を実施したが、Tm値に変動は認められなかった。SDS-PAGEによる解析を実施したところ、不純物の影響が確認された。ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製度を向上させることでタンパク質性状が安定したことから、タンパク質性状に影響を与えているのは不純物であることが判明した。
４．タグフリータンパク質の調製
調製したタンパク質はタグ付加タンパク質であるため、タグ切断および除去によりタグフリータンパク質を調製した。
５．タグ付加タンパク質およびタグフリータンパク質の保存条件検討
各タンパク質について、温度条件3種類、保存期間5種類を組み合わせた計15条件での保存安定性をTSA、SDS-PAGE、SECなどの解析ツールを使用し、確認した。

Biacore T-200 を使用し、ビオチン化した特定配列を Series S Sensor Chip SA に固定化した後、特定配列に対する相補的配列を持つアプタマー3 種をそれぞれハイブリダイズした。その後、アナライトとしてウイルスタンパク質を添加し、Single-cycle kinetics法によってアプタマーとウイルスタンパク質の相互作用を解析した。

委託者よりご提供いただいたヤギ乳サンプルについて、限外濾過法による低分子量・高分子画分の分離、陰イオン交換クロマトグラフィーによる分離、陽イオン交換クロマトグラフィーによる分離により4つの分画に成分を分離し、タンパク質定量およびSDS-PAGEによる分析を実施した。

400種類のタンパク質の発現精製を目的とし、まずは17種類のタンパク質で発現精製可能かどうかの検討を実施した。発現精製方法は400種類のタンパク質を調製する方法と同様とし、ハイスループットのスモールスケール培養および簡易精製で実施した。簡易精製したタンパク質の酵素活性測定サンプルを調製して委託者に送付した。委託者の測定により酵素活性が確認されたため、酵素活性測定可能な発現精製方法が確立されたと判断し、本試験（400種類のタンパク質の発現精製）に進んだ。

予備検討で酵素活性を保持した発現精製プロトコールが確立されたため、本試験として400種類の大規模なタンパク質発現精製を実施した。400種類のタンパク質を簡易精製後、活性測定用サンプルを調製し、試験委託者に納品した。

本試験では、MBPタグ融合膜タンパク質41種を対象に、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の合成およびアフィニティー精製を実施した。高純度プラスミドの調製後、リポソーム非添加および添加条件下でタンパク質合成を行い、SDS-PAGEにより目的タンパク質の確認を行った。さらに、プロテオリポソームの可溶化とMBPタグを用いた精製を通じて、各サンプルから精製タンパク質を得た。得られた結果は、膜タンパク質の挿入効率や精製収量に関する知見を提供し、今後の膜タンパク質研究や製剤開発に資するものと考えられた。

本試験では、doxycycline誘導型発現システムおよびPiggyBacトランスポゾン技術を用いて、200kDa超の大型膜タンパク質（6000bp以上）を安定発現する細胞株を構築した。薬剤耐性プール細胞および単離細胞クローンに対し、qPCRおよびWestern blotを実施し、RNAおよびタンパク質の発現を確認した。DOX濃度依存的な発現誘導が認められ、目的タンパク質の分子量に一致するバンドシグナルが検出された。得られた10種の細胞クローンを委託者に提出した。Transposon Vectorを利用することで、プラスミドを効率的に細胞ゲノムに取り込むことができた。また、レンチウイルスベクターを使わなかったため、潜在的なRCRやRCLリスクがないと考えられた。

標的タンパク質の活性を阻害する低分子化合物のバーチャルスクリーニングを実施した。標的タンパク質上の他のタンパク質と結合するポケットを標的とし、Enamine社のHit Locator Libraryを用いて約45万化合物を評価。SMINAによるドッキングスコアを活用し、複数の有望な候補化合物を選抜した。

動物組織由来の膜タンパク質の精製条件を最適化し、大量精製を実施した。過去の試験結果を踏まえ、冷凍組織1kgを2回に分けて処理し、膜画分抽出から可溶化、アフィニティ精製までを一貫して行った。アフィニティカラムを用いた精製により、計16.1mgの高純度膜タンパク質試料を取得した。精製工程では界面活性剤の交換や遠心分離条件の最適化を通じて、脂質混入の抑制と収量向上を達成した。次回試験では濃縮工程の効率化を図る予定である。

【細胞上清からの目的組換えタンパク質の調製】
細胞培養上清からの目的組換えタンパク質の精製方法について、ロード法およびバッチ法の二種類を比較した。SDS-PAGEおよびゲルろ過クロマトグラフィー（SEC）分析により精製タンパク質の性状を確認した結果、いずれの方法でも同等の品質の目的組換えタンパク質を精製できることが判明した。27種類の細胞培養上清から精製した目的組換えタンパク質の酵素活性について評価した。また、目的組み換えタンパク質の自己切断についても評価した。
【リガンド-受容体のin vitro 評価系の構築（タンパク質発現精製～評価系構築まで）】
リガンド（哺乳類細胞発現系）および受容体（大腸菌発現系）について発現ベクターを構築し、各発現系での発現条件および精製条件について検討した。大腸菌発現系においては封入体からのタンパク質調製のため、理フォールディング条件についても検討した。検討結果から最適な発現条件、精製条件、リフォールディング条件を決定し、その条件に基づいてリガンドおよび受容体を調製した。調製したリガンドおよび受容体を用いたプルダウンアッセイにより相互作用解析を実施し、in vitro評価系を構築した。
【酵素精製プロトコールの立案、調製および活性評価】
文献を調査し、ある酵素についてマウス器官・組織またはヒト培養細胞からの精製プロトコールを立案した。
立案したプロトコールに基づき酵素を精製後、活性を評価し、立案したプロトコールで活性を有する酵素の調製が可能であることを確認した。

NanoBiT技術を活用し、安定発現細胞株を用いて細胞内タンパク質間相互作用 (PPI) を定量的に解析した。100種類の化合物について、阻害活性（IC50）をルシフェラーゼ活性およびMTSアッセイにより算出した。アッセイバリデーションでは、細胞数や阻害剤濃度の最適条件を確立し、Z’-factor > 0.5、変動係数 (CV) < 10%を達成した。陽性対照阻害剤による検証では、文献値と整合する結果が得られた。

NanoBiT技術を用いたin situタンパク質間相互作用解析を実施するため、目的タンパク質融合LgBiTおよびSmBiTを共発現する安定発現細胞株を作製した。LgBit融合タンパク質は野生型と変異型の計2種類を使用した。薬剤耐性を獲得した細胞（プール）について、ルシフェラーゼ活性測定（NanoBiT assay）および阻害活性測定を行ったところ、ルシフェラーゼ活性および阻害活性が確認された。さらに、細胞ライセートを用いたウェスタンブロットにより、導入したタンパク質の発現を確認した。薬剤耐性細胞プールからルシフェラーゼ活性の高いクローンを選抜後、シングルクローン化し、タンパク質相互作用 (PPI) 解析に使用した。

脳画像解析ソフトウェアClearMapを用いて、脳全体の細胞検出および位置合わせ処理のワークフローを検証した。Allen Brain Atlasを参照し、ClearMapのインストールからGUI操作、CellMap・Alignment機能の動作確認、外部ツールElastixとの連携による画像登録処理までを実施。複数のエラー解析とパラメータ調整を通じて、脳画像データの自動解析精度向上に向けた技術的課題を抽出した。

Allen Mouse Brain Atlasを活用した脳画像データの統計解析および可視化フローの設計・実装を行った。Python環境下での仮想環境構築から、Jupyter Notebookによるデータ処理、統計値算出、群間検定、BarChartおよびHeatMapによるインタラクティブなグラフ表示までを一貫して支援。脳領域ごとの陽性面積や平均輝度などの指標を用い、階層構造に基づく可視化を実現した。研究開発現場における脳画像解析の高度化と再現性向上に貢献すると考えられた。

脳画像データの高精度変換と可視化に向けたPythonスクリプトの実装・検証業務
Brain atlasを活用した脳画像解析において、.ims形式の大容量画像データを.tiff形式へ変換するPythonスクリプトの実装と検証を実施した。仮想環境構築からスクリプトの修正、ImageJ/Fijiによる画像のリサイズ・軸変換まで一連の処理手順を確立。さらに、ダウンサンプリングやチャンネル分離、解像度設定などの追加検証を通じて、委託元の要件に応じた柔軟な画像処理フローを構築した。本業務により、脳画像解析の精度向上と処理効率化に貢献する技術的基盤を提供した。

試験委託者よりご提供いただいた46種類のタンパク質サンプルについて、緩衝液によりアッセイに適したタンパク質濃度に調製した。n=2でサーマルシフトアッセイ（TSA）を実施し、Tm値を算出した。Tm値が算出できなかったサンプルについては、初期蛍光値、波形および予測構造からタンパク質の状態について推測し、とりまとめて報告した。

某プロテアーゼを対象に、阻害剤設計を目的とした変異体の構造予測および機能解析を実施した。ESMFoldによる立体構造推定、P2Rankによるポケット予測、自然言語処理（esm1v）によるスコアリングを組み合わせ、1444種の変異体を網羅的に解析。分子表面の形状、電荷、疎水性、水素結合といった特徴量を抽出し、クラスタリングと次元削減により変異体の分類と可視化を行った。得られた結果は、阻害剤との相互作用部位の最適化や変異体の優先順位付けに活用された。

某プロテアーゼに対し、活性向上を目的とした変異体設計を実施した。自社開発のin silico解析により、活性中心近傍のアミノ酸残基を選定し、3533種の変異体構造を予測。分子表面の形状・電荷・疎水性・水素結合の特徴量を抽出し、クラスタリングと次元削減により25クラスに分類。構造安定性や基質との相互作用を評価し、22種の有望な変異体候補を選定した。本解析は、構造生物学・タンパク質工学・AI解析技術を融合した先進的な手法と考えられる。

GruffiとSeuratを統合したパイプラインを構築し、オルガノイドのシングルセルRNA-seqデータを解析した。Velocity解析により細胞分化の動態を推定し、fate解析ではSlingshotおよびCondimentsを用いて分化経路と分化選択の違いを明確化した。そして、某疾患の影響により深層神経細胞の分化が阻害される傾向を確認した。Tradeseq解析により遺伝子発現の変化を統計的に評価し、GO解析で機能的な特徴を抽出した。高精度な分化推定と条件間比較により、某疾患の分子基盤解明に貢献した。

目的タンパク質の合成遺伝子を酵母発現用ベクターのマルチクローニングサイトに挿入して作製した発現プラスミドを酵母に導入して形質転換体を作製した。コロニーPCRにより目的遺伝子が挿入されていることを確認後、単離した16クローンについてスモールスケールで発現誘導し、ウェスタンブロット評価により高発現株を取得した。発現条件を最適化し、最適化条件で500 mLスケールの発現誘導培養を実施した。ミセル水性二相分配法 and/or Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィーにより目的タンパク質の精製条件を検討し、精製条件を最適化した。

試験委託者より提供いただいた23種類の酵素の発現ベクターを形質転換し、大腸菌発現系を用いて目的タンパク質を発現させた。回収した菌体ペレットについて、2種類の抽出条件で可溶性画分を調製した。SDS-PAGEにより可溶性画分への目的タンパク質の局在を確認した。調製した可溶性画分を使用して2種類のバッファー条件下で活性を測定し、酵素活性について評価した。

10種の化学物質を対象に、三次元皮膚モデルを用いたEpiSensA法により皮膚感作性を評価した。各物質は適切な溶媒で調製し、皮膚モデルに添加後、LDHアッセイによる細胞毒性評価と、Real-time PCRによる4種類の感作性関連遺伝子の発現解析を実施した。一部物質では濃度依存的な遺伝子発現上昇が認められたが、細胞生存率が80%未満となった場合は試験不成立と判断した。GAPDHのCt値を基準に試験の妥当性を確認し、溶媒や濃度による影響も検討した。本試験により、皮膚感作性評価における細胞毒性と遺伝子応答の関係性が明らかとなり、化学物質の安全性評価に資する知見が得られた。

診断用遺伝子増幅試薬について、ヒト検体を用いた月1回の定期モニタリングを実施した。試験委託者指定のプロトコールに従ってモニタリングする必要があったため、技術移管して手技に問題がないことを確認した。測定結果は所定の解析ツールで解析し、解析データを報告書として提出した。測定機器については使用前後に日常点検を実施し、点検記録を提出した。

試験委託者よりご提供いただいたタンパク質凍結乾燥サンプルを指定のバッファーに溶解し、3条件の保存温度における経時的な分解の有無をSDS-PAGEおよびWestern blottingによって検証した。その結果、どの条件においても目的タンパク質の有意な経時的減少は確認されず、安定性の高いタンパク質であることが示唆された。一方、経時的に低分子量側（1000 Da 以下）にスメアなバンドが生じることが確認された。また、別途試験委託者よりご提供頂いた 4 サンプル（1-1, 2-1, 1-2, 2-2）についてはウェルに添加可能な最大量（サンプルバッファーを含めて 15 μL）を添加しても、Oriole 蛍光ゲルステイン及び 2 種
の抗体の Western blotting のいずれにおいても明確なバンドは認められなかった。Oriole 蛍光ゲルステインによる染色では、わずかに 1000 Da 以下の領域にスメアバンド様の蛍光が認められた。

5種類の培地、3種類のセルライン、2種類のFeed培地を使用し、17日間細胞を培養した。起眠時をday0とし、day6、day9、day13、day15、day17でサンプリングし、培養上清の分取および細胞抽出試薬による細胞抽出液の調製を実施した。起眠時、継代時およびサンプリング時には生細胞数を測定し、生存率を算出した。細胞数測定データ、培養上清および細胞抽出液を納品した。

本試験はバイオ触媒として注目される3種の酵素（Transferase、Decarboxylase、Dehydrogenase）について、各酵素のホモログから高活性を示す候補を選抜することを目的とした。Transferaseに関しては、8種のコンストラクトを用いて発現条件の最適化、発現・精製、活性測定系の構築を実施し、酵素活性測定により活性を示すコンストラクトを特定した。さらに、DecarboxylaseおよびDehydrogenaseについても、可溶性発現の確認を行い、今後の精製・活性評価に向けた基盤を整備した。本試験により、目的酵素群の発現・精製および機能性に関する実証データを取得できた。

試験委託者より提供された磁性粒子に対し、シリカコーティング処理の条件最適化を目的として、従来条件およびその0.75倍・0.5倍の3条件下で被覆処理を実施した。各条件において、粒子の表面処理、洗浄、被覆、乾燥までの工程を詳細に検証し、得られた粒子の収量および物理的性状を比較した。処理後の粒子については、洗浄工程により上澄みの透明性が向上したことから、十分な被覆と洗浄が達成されたと判断された。また、磁性粒子の収量は条件により差異が見られ、定量的データより磁性粒子のシリカコーティング処理最適条件が決定された。

某酵素を対象に活性検出系の構築および最適化を実施した。検出法は、基質および反応生成物での検出が困難であったため、下流反応に別の酵素を組み合わせた間接的検出法を採用した。使用する酵素、基質、補因子などの濃度条件を検討し、酵素活性測定系を最適化した。4種のホモログを比較した結果、2種類のホモログにおいて活性が示唆され、より活性の高い1種類について高温条件下でも活性が保持されることを確認した。本試験では、高温環境下での酵素活性評価における技術的課題を克服し、実用的な測定系を構築可能であることが示唆された。

点眼薬製剤化を目的として、点眼薬原薬の各pHおよび温度条件下における溶解度および保存安定性を評価した。各pHに応じて適切な緩衝液を使用し、HPLCによるピーク面積の定量から溶解度を算出した結果、pH 9での溶解度は他の条件の約5倍に達した。保存安定性試験では、3条件の各温度で3日間保存後の残存量を測定し、pH 7〜9では高温条件下でも比較的安定性が維持されることを確認した。一方、pH 5〜6では高温条件下での分解が顕著であった。これらの結果により、製剤化における適切なpHおよび保存条件が選定された。

本試験では、抗体（IgG）および抗体薬物複合体（ADC）3種について、示差走査型カロリメトリ（DSC）を用いた熱安定性評価を実施した。IgGでは2つのTm値のピークを示し、ADCではそれぞれのピークが漸減傾向を示したが、構造不安定化の兆候は認められなかった。1種類のADCではマイナーピークの解析が困難であったが、メジャーピークはIgGとほぼ同等であり、熱変性に対する構造保持性が示唆された。各サンプルのΔHおよびΔSも算出し、定量的な比較を通じてADC化による構造変化の影響を検証した。本試験により、抗体およびADCの製剤開発における熱的安定性の指標を確立することができた。

ゼラチン（コラーゲン）に含まれるアミノ基の定量法を確立することを目的とし、TNBS法およびニンヒドリン反応を用いた測定系の安定性を検証した。原料ゼラチンおよび処理後ゼラチンを有機溶媒あるいは水に溶解し、NanoDropによる濃度定量と吸光度測定を実施した。両定量法において、原料ゼラチンのアミン含量は処理後ゼラチンより高い値を示した。また、完全変性条件下での測定では、変性剤がニンヒドリン反応を阻害する可能性が示唆され、代替手法の検討が必要とされた。変性剤を用いないニンヒドリン反応およびTNBS法では原料ゼラチンは処理後ゼラチンよりも相対的に高いアミン含量を示し、測定系に問題はないことが確認された。

目的タンパク質の大腸菌発現系における添加剤の添加により、菌体増殖および目的タンパク質の発現量に与える影響を評価した。先に培養温度2条件、IPTG濃度2条件の計4条件での発現検討を実施したところ、各条件において発現量に変化は認められなかった。比較的緩やかな条件を選択し、添加剤濃度を4濃度添加して発現量を比較した。その結果、添加剤の有無および添加剤の濃度により菌体増殖や発現量に大きな変化は認められなかった。

本試験では、遺伝子増幅検出試薬の品質維持と性能確認を目的として、長期にわたり継続的に定期的な製品モニタリングを実施した。試験委託者より提供された複数ロットの試薬および検体を用い、月毎に測定計画を立案し、測定機器により試薬の遺伝子増幅試験を実施した。測定結果はCSVおよびDAT形式で出力し、Excel入力シートへの転記・解析を行った後、所定の報告書フォーマットにまとめた。加えて、測定機器の日常点検、データ管理、報告書提出などの付随業務も実施し、運用体制の信頼性を確保した。

最大60種のタンパク質サンプルについて、Thermal Shift Assayにより熱安定性を評価した。各サンプルは試験委託者より提供された測定用緩衝液で希釈し、リアルタイムPCR装置により蛍光強度の変化を測定した。得られたRawデータを微分処理し、蛍光強度変化率が最大となる温度をTmとして決定した。各タンパク質の変性曲線とTmは報告書にまとめて提出した。

試験委託者より提供された8種のペプチド製品を対象に、凍結乾燥製剤の試作と保存安定性・純度・回収率の評価を実施した。事前検証により、各ペプチドは指定バッファーにて溶解可能であることを確認し、凍結乾燥後の再溶解試料を逆相HPLCにて分析した。バッファー条件や添加剤による凍結乾燥性状の変化を視認し、ケーキ形成や濃縮効果を評価した。さらに、フィルトレーション前・凍結乾燥前・凍結乾燥後の各段階でのピーク面積を比較し、回収率も問題ないことを確認した。本試験により、ペプチド製剤の凍結乾燥工程における品質保持および製品設計の最適化について技術的な知見が得られた。

シリカコート磁性ビーズのDNA結合能について評価した。試験委託者より提供された磁性ビーズを用い、DNA溶液との結合反応を複数条件で実施し、洗浄工程後のDNA残存量を定量的に測定した。さらに、溶出工程におけるDNA回収率を比較し、ビーズ表面のシリカ層が結合効率に与える影響を検証した。結果として、特定条件下で高い結合率と回収率となることを確認した。

子嚢菌由来抽出液を調製し、イムノブロット法を用いてタンパク質定量を実施した。菌体からの抽出は界面活性剤を含む緩衝液で行い、遠心分離により可溶性画分を回収した。得られた抽出液をSDS-PAGEで分離後、PVDF膜に転写し、特異抗体を用いたイムノブロット解析により目的タンパク質の検出を行った。標準タンパク質との比較により定量性を確認し、抽出条件の最適化により高い再現性を確保した。さらに、検出感度やバックグラウンド低減のためのブロッキング条件を検証し、信頼性の高い測定系を構築した。

封入体からのリフォールディング精製による目的タンパク質の調製およびその再現性を検討した。試験委託者より提供されたグリセロールストックを用いてタンパク質発現誘導培養を実施し、得られた菌体より封入体を調製した。封入体を可溶化後、陰イオンカラムクロマトグラフィーにより精製してリフォールディングし、陽イオンカラムクロマトグラフィーにより精製した。ゲルろ過クロマトグラフィーにより最終精製し、目的のタンパク質を取得した。3回試行し、いずれの試行においても目的タンパク質を取得できることが確認された。

4種類の膜タンパク質であるイオンチャンネルを同時に発現するHEK293安定発現株を作製した。細胞内の遺伝子発現量の変化を確認するため、可逆的に遺伝子発現量を調節可能な発現カセットを導入し、RNAおよびタンパク質発現量を検証した。qPCRおよびウェスタンブロットにより、薬剤選択細胞プールで4種類のイオンチャンネルの発現を確認後、限界希釈法によりシングルセル化し、シングルクローンを取得した。取得した10クローンの単離クローンについて4種類のイオンチャンネルの発現量をqPCRおよびウェスタンブロットにより高発現であることを確認後、凍結保存した細胞クローンを提出した。

試験委託者提供のマイクロキャリアおよび市販のマイクロキャリアについて、細胞接着性および細胞増殖性を指標として評価した。細胞接着性試験の顕微鏡観察においてマイクロキャリアの大きさが異なることを確認したため、細胞増殖性試験においては表面積が同等となるように、試験委託者と協議してマイクロキャリアの使用量を変更した。試験委託者提供のマイクロキャリアについて、細胞接着性および細胞増殖性は示されたが、別の課題もあることが確認された。

GCリッチな繰り返し配列を含む検体のサザンブロット解析 (Southern blotting) を実施するにあたり、試験委託者提供の陽性対照においてバンドが検出され、かつ陰性対照においてはバンドが検出されない条件を決定するため、3 種類のプローブを作製し、様々な条件下で予備検討を実施した。予備検討結果をもとに、最も検出感度の高いプローブおよび条件を選択し、5種類の検体について本試験を実施した。その結果、5検体中4検体で目的の配列が挿入されていることを確認した。

試験委託者提供のキナーゼサンプルについて、市販品を対照として酵素活性を測定し、キナーゼ活性を定量的に評価した。予備検討として一部のキナーゼサンプルについて標準的な反応時間で活性を測定し、使用した活性測定系で有意なキナーゼ活性を検出できることを確認した。本試験として、各キナーゼサンプルについて酵素活性を測定し、一部のキナーゼサンプルについてはコントロールよりも顕著に高い比活性を持つことが明確に示された。本試験で有意な活性が検出されなかったキナーゼサンプルについては、キナーゼ活性の有無を精査するために、反応時間を延長して酵素活性を測定した。その結果、キナーゼサンプルの一部については、本試験において市販品と比較して有意な活性が検出されなかったものの、キナーゼ酵素活性を保持することが示唆された。

野生型、変異型を含む3種類のDNase遺伝子を対象に、哺乳類細胞発現系を用いてタンパク質を調製した。予備検討として、スモールスケールでの発現確認により、目的タンパク質が主に培養上清に分泌されることを確認し、目的タンパク質収量および純度が最大となる培養条件を決定した。100 mLスケール培養で得られた培養上清から固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー (IMAC) 精製により高純度の目的タンパク質を取得し、 DNase活性測定を実施した。その結果、変異型は野生型の1/1000程度の活性であることが示された。また、試験で使用したHost細胞のウイルス否定試験を実施し、HAV、HBV、HCV、HIV-1、HIV-2 および HTLV に感染していないことを確認した。

多量体を形成していると考えられるタンパク質試料について、多量体の分子量を推定するため、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析および Blue Native PAGE (BN-PAGE) 分析を実施した。SEC分析については、標準タンパク質を用いて分子量換算のキャリブレーションを実施し、試料のクロマトグラムから主ピークの保持時間を解析して分子量を算出した。単量体の分子量から、本試料中には単量体の他に6量体、12量体が含まれていると考えられ、 6 量体の含有率が最も高いという結果となった。Blue Native PAGE (BN-PAGE)による分子量解析においては、単量体および12量体が含まれていることが確認された。BN-PAGEでは6量体が確認できなかったが、これは分析時のバッファー組成の違いによると推察された。以上の結果より、 6 量体が基本的な多量体であると考えられたが、より正確に決定するためには、X 線結晶構造解析またはクライオ電子顕微鏡による単粒子解析により構造決定する必要があることが示唆された。

3アミノ酸のリピートタンパク質について、大腸菌BL21(DE3)株を用い発現条件を検討した。MBPおよびHisタグを付加した3アミノ酸の20リピートタンパク質および100リピートタンパク質を対象に、IPTG濃度2条件、培養温度2条件の計4条件で比較した。SDS-PAGEによる発現確認により、20リピートタンパク質は最適な発現条件を決定することができたが、100リピートタンパク質は検出不能なほど発現量が低かったため、発現条件は決定できなかった。100リピートタンパク質は形質転換後のコロニー形成が少ない傾向があり、標的タンパク質の毒性や発現抑制の可能性が示唆された。

3種類のN末端ビオチン化タンパク質を対象に、昆虫細胞発現系を用いて発現条件を検討した。各タンパク質はビオチン化タグを付加した構造で設計し、発現ベクターを構築した。PCRによりバクミドDNAへの目的配列の挿入を確認後、昆虫細胞に導入して培養を行った。組み換えバキュロウイルスを調製し、ウイルス力価を確認した。目的タンパク質の最適発現条件について検討し、3種類の目的タンパク質について最適な発現条件を決定した。

市販の抗体についてHRP標識効率を検証するため、複数の反応条件でペルオキシダーゼ標識し、最も効率の良い条件でHRP標識抗体を作製した。作製したHRP標識抗体の活性を測定し、最も活性の低い標識抗体および最も活性の高い標識抗体、捕捉抗体および抗原を用いて、サンドイッチELISAを実施した。バックグラウンドが少なく、測定値が高い標識抗体および反応条件を決定し、サンドイッチELISAのプロトコールを確立した。さらに、ELISAに使用するHRP標識抗体を大量調製し、納品した。

抗体と抗原の結合特性を評価するため、表面プラズモン共鳴（SPR）法を用いて相互作用解析を実施した。センサー表面に抗原を固定化し、リガンドの固定化条件の検討後、抗体を流路に導入してリアルタイムで結合・解離を測定した。得られたセンサグラムから、結合速度定数（ka）、解離速度定数（kd）、および平衡解離定数（KD）を算出し、親和性を定量的に評価した。解析は複数濃度の抗体を用いて行い、濃度依存性と再現性を確認した。結果として、各抗原×各抗体の組み合わせで相互作用の有無および高低を確認することができた。

乳酸菌の洗浄画分に含まれる内在性タンパク質の精製のため、まずはSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングにより目的タンパク質の検出が可能であることを確認した。次にスモールスケールで陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーでの精製を検討した。その結果、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて目的タンパク質を高純度に精製するプロトコールを確立した。確立したプロトコールを用いて目的タンパク質の大量調製を実施し、その精製タンパク質を納品した。

試験委託者から提供された遺伝子組換え出芽酵母を用いて、目的タンパク質の発現および精製を実施した。タンパク質の発現精製プロトコールは、試験委託者提供のプロトコールに従った。最初にスモールスケールで発現精製を実施し、プロトコールがトレースできることを確認した。次にスケールアップして目的タンパク質の発現精製を実施し、精製タンパク質を納品した。

目的タンパク質発現に用いる形質転換酵母を調製するため、エレクトロポレーション法を採用した。最初にホストとなる酵母のコンピテントセルを調製した。試験委託者から提供された目的タンパク質発現プラスミドを用いて酵母を形質転換し、10クローンについて10 mL スケールで発現誘導培養した。取得した菌体ペレットについて3種類の抗体を用いてウェスタンブロットを実施し、最も発現量の多いクローンを選抜した後、高発現株として納品した。

試験委託者から送付していただいたデータ処理済みのMTZファイルについて、aimless.log の統計値について確認するとともに、CCP4のProgramを用いたSfcheck による評価、Matthews Coef による非対称単位中に存在する分子数の見積り、Self-rotation function による結晶学的および非結晶学的対称軸の確認を行った。また、生データをXDSを用いて処理し直すことにより分解能の向上を試みた。その結果、さらに高分解能な回折強度データを取得することができた。取得したデータを基に初期位相を決定し、Program Cootによるモデル構築および修正の後、Program Refmac5による構造精密化を繰り返した。最終構造は試験委託者の許可を得た上でPDB Validation Serviceにより評価し、PDBに登録可能なレベルまで微修正後、最終構造を取得した。最終構造のPDBファイルおよび位相の入ったMTZファイルを提出した。

ヒト脂肪前駆細胞に11種の被験物質を濃度・組合せを変えた30条件で添加し、脂肪細胞への分化抑制効果を標的遺伝子の発現で評価した。前駆細胞をコンフルエントまで培養後、各条件で72時間分化培養し、qPCRにより標的遺伝子とβ-actinを測定、ΔΔCt法で相対発現量を算出した。溶媒コントロールとの比較はDunnett検定で実施し、6条件で標的遺伝子の発現量が有意に低下した（p<0.05）。特に3条件では20％以上の低下を示した。これらの条件において脂肪細胞への分化抑制が示唆され、脂肪蓄積の減少に繋がる可能性が考えられた。

委託者提供の試料液成分中のイノシトールをTLCで分析した。標準液は委託者提供の定量用イノシトールを使用した。TLCプレートに標準液および試料液を同量スポットし、アセトンを含む展開溶媒で展開した。展開したTLCプレートを染色後、染色像を撮影した。試料溶液ではイノシトール由来とみられるスポットに加え、未同定の2スポットを検出した。ろ紙の有無による分離能についても検討し、大きな差はないことを確認した。

ヒト由来イオンチャンネルタンパク質を対象に、Twin‑Strepタグ融合体およびFLAGタグ融合体の2種類の発現プラスミドを構築後、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系により両コンストラクトともに合成されていることを確認した。それぞれのタグによるアフィニティー精製を実施したところ、Twin‑Strepタグ融合体は精製不可、FLAG-tag融合体は精製可能であったことから、目的のヒト由来イオンチャンネルタンパク質はコムギ無細胞合成系により発現精製できる可能性が示唆された。技術移管では、転写・翻訳・精製・可溶化の一連操作を委託者立会いのもと実施し、技術移管の全工程を完了した。

ヒト由来細胞増殖因子タンパク質を発現させた植物サンプルを用い、ヒト細胞増殖因子タンパク質抽出条件の最適化、検出、ならびに単離精製を試みた。まず最初に、植物サンプルにヒト細胞増殖因子タンパク質が発現していることを確認するため、植物サンプルを溶解したライセートを用いてウェスタンブロット解析した。その結果、ヒト細胞増殖因子タンパク質が植物サンプルで発現していることが確認された。次に、抽出条件を最適化するため、複数の抽出バッファーを用いてヒト細胞増殖因子タンパク質を抽出し、抽出効率を確認した。その結果、最も抽出効率の高い抽出条件でも30%程度ということが判明し、ヒト細胞増殖因子タンパク質が不溶化している可能性が示唆された。また、冷蔵保存および冷凍保存した植物サンプルについてヒト細胞増殖因子タンパク質の保存安定性を確認したところ、冷凍サンプルと比較して冷蔵サンプルはヒト細胞増殖因子タンパク質が分解されていることが確認された。さらに、抽出したヒト細胞増殖因子タンパク質についてエンドトキシン濃度を測定した。

直径1mm以下のアルギン酸マイクロビーズを作成するための条件を検討した。検討項目は使用する器材の内径、滴下速度などとした。水を用いた予備検討により、器材および滴下速度の最適な条件を決定した。次にアルギン酸ビーズの小径化の条件検討を実施した。目的の1 mm以下のビーズを取得できたが、直径の均一性や再現性に課題が残った。本試験条件では直径を一定に保った大量生産が困難である一方、目的とする小径ビーズ自体は取得できていることから、別工程の併用により所望径の調製が可能と考えられた。

委託者より提供された2種類の酵素について、各酵素に応じた基質を用いた活性測定系を構築し、ロット間の活性を定量評価した。1種類については、想定していた基質特異性が認められなかったため、別の基質を用いた活性測定系を構築した。構築した活性測定系を用いて酵素活性のロット間差を確認したところ、ロット間差は確認されなかったため、各酵素の活性測定能は一定の基準を満たしていると評価された。

ウイルスの処理工程におけるウイルスゲノムRNAの分解評価系を構築するため、バイオアナライザーおよびqPCRを用いて検出可否および検出限界を検証した。バイオアナライザーを用いた検討より、ウイルスゲノムRNAの検出および分解を評価可能であることが確認されたが、検出感度に課題があることが判明した。一方、qPCRを用いた検討においては、検出感度は高感度だったが分解に関する評価が困難であることが確認された。

患者および健常者由来 iPS細胞から分化させた細胞について細胞外活動電位計測機 MEA (Microelectrode Array) にて測定し、薬理応答における電気生理学的な特徴を解析した。まず、薬理試験の実施に最適な培養時期を決定するための予備検討を実施し、最適な測定時期を検証した。患者および健常者由来 iPS細胞から分化させた細胞の自発活動の解析では、オシレーション頻度、オシレーションの強度には顕著な差異は認められなかった。薬理試験では、健常者由来細胞において濃度依存的にオシレーション頻度が有意に上昇したのに対し、患者由来細胞では減少した。本解析により、健常者由来細胞と患者由来細胞との薬理応答の相違が明らかとなった。

ヒトiPSC由来ニューロンにおける神経成長因子の機能解析のための評価系構築を目的とし、siRNAを用いて神経成長因子の発現を低下させ、神経マーカーの発現およびE/I 比の変化を解析した。グルタミン酸作動性ニューロンおよびGABA作動性ニューロンをアストロサイトと共培養し、siRNAを導入して神経成長因子の発現を低下させた。L-glutamate、GABA など複数の指標を用いて免疫染色し、いずれの条件でも各マーカーの陽性染色が確認された。L-glutamateおよび GABAの蛍光強度に基づき E/I 比を算出し、最終的に初期比率と同程度となる比率を確認した。処理条件検討により、神経成長因子発現低下ニューロンを用いたMEAでの評価系を構築した。検討試験終了後、ニューロンからRNAを抽出し、委託者に提出した。

ヒト疾患モデルニューロンを用いた被験物質の機能修復効果を評価することを目的とし、ニューロン機能のプロファイルを対照化合物により検討した。健常株または疾患モデルのヒトiPSC由来ニューロンおよびアストロサイトを単培養または共培養し、一定の培養期間後、対象物質を累積添加した。培養期間中、神経活動を週次で計測し、計測で得られた神経活動データから電気生理学的パラメータ各種を算出し、統計学的な多変量解析により培養条件による差異を検証した。MEAによる神経活動の計測後、細胞からRNAを抽出し、cDNA を調製して委託者に提出した。

先の試験で構築した評価系を用いて薬剤および対照薬についてMEAを実施し、電気生理学的パラメータ各種の指標を算出して活動電位を評価した。品質確認として受容体拮抗薬を段階添加し、抑制・興奮方向の変化を確認した。続いて、薬剤および対照薬を添加し、自発活動を測定した。統計学的な多変量解析により、薬剤および対照薬間のパターン差を可視化した。遺伝子解析のため、同様の操作を行ったニューロンからRNAを抽出し、委託者に提出した。

委託者提供の2種類のタンパク質試料について、結晶構造解析が可能かどうかを確認するため、結晶構造解析用タンパク質試料の調製、タンパク質試料の評価および結晶化条件の簡易的初期スクリーニングを行った。まずは結晶構造解析用の試料調製のため、Hisタグの切断条件を検討し、十分に切断可能な酵素反応条件を決定した。決定した反応条件によりHisタグを切断して除去し、ゲルろ過精製によりHisタグを除去したタンパク質試料を調製後、動的光散乱（DLS）により精製したタンパク質を評価した。DLSの結果、良質な結晶が取得できる可能性が高いことが確認された。結晶化条件の簡易初期スクリーニングにより、いずれのタンパク質においても微結晶が確認され、結晶構造解析可能な良質な結晶が取得できる可能性が高いことが示唆された。これらの基礎検討により、結晶構造解析に必要なタンパク質試料の量、良質な結晶を取得するための精製方法および結晶化条件スクリーニングの方向性を確認できた。

ヒトiPSC由来ドーパミンニューロンをアストロサイトと共培養後、MEAシステムを用いて自発発火活動を計測し、化合物による神経活動変化を評価した。陽性対照、陰性対照を含む10種類の化合物を5段階濃度で累積添加し、各段階で細胞外電位を測定した。得られたMEAデータから15種類の電気生理学的パラメータを算出し、ヒートマップで活動変化を可視化した。主成分分析（PCA）では、試験化合物のプロット位置から活性の有無および毒性様応答を判定した。陽性対照は濃度依存的に活性を示し、毒性様応答が確認された。被験物質では低濃度から活性化傾向を示すもの、最高濃度のみ活性を示すものが確認された。さらにラスタープロット画像を用いたAI解析により、化合物作用の予測を行い、セロトニン、ドーパミン、GABAに類似した応答を示す可能性が示唆された。

被験物質についてヒトiPSCニューロンのグルコース取り込みに及ぼす影響および糖輸送体発現解析を実施した。ヒトiPSC由来ニューロンおよびアストロサイトを共培養後、基質および被験物質の濃度条件を組み合わせ、ニューロンのグルコース取り込み量を発光アッセイにより測定した。その結果、被験物質にはグルコースの取り込みを抑制する効果があることが示唆された。また、培養後のプレートからRNAを抽出してqPCRにより糖輸送体の発現量を測定し、被験物質による糖輸送体への影響を確認した。

ヒトiPSC由来感覚ニューロンをMEAプレートで培養し、ヒトiPSC由来腸管上皮細胞をトランスウェルで共培養した。被験物質を腸管上皮側に添加し、感覚ニューロンの細胞外電位を計測した。発火頻度などの電気生理パラメータを算出し、統計検証した。添加直後の一過性変動や経時変化を解析した結果、条件により発火頻度の上昇傾向や減少傾向が確認された。電極単位の分布解析では、腸管上皮を介した条件で高倍率の発火増加電極が広く観察された。試験終了後、培養上清の回収およびRNA/タンパク質抽出を実施し、委託者に提出した。

健常株およびALS疾患モデルiPSCニューロンおよびアストロサイトをMEAプレートに共培養し、陰性対照を含む各化合物により処理した。神経活動は定期的に測定し、スパイク検出、バースト特性、ネットワークバースト頻度など多数の電気生理パラメータを算出した。健常株とALS疾患モデルでは自発活動の立ち上がり時期やバースト出現時期が異なり、化合物処置に対する応答も細胞株間で差が生じることを確認した。主成分分析では特定パラメータが健常株と疾患株で有意差があることが確認され、化合物の影響評価に利用できることが示唆された。

BALB/c系胎児マウスから大脳皮質組織を採取し、解剖操作・組織分離・酵素処理・細胞懸濁工程を含む一連の採取プロトコルを委託者とともに実施した。採取した細胞はガラスボトムプレートに播種して培養した。培養期間中は経時的に形態観察して明視野画像を取得した。培養終了後、免疫染色を実施した、神経突起形成およびシナプス形成を確認した。培養プロトコル、形態画像および免疫染色画像のデータを委託者に提供し、マウス初代大脳皮質ニューロン培養系の技術移管を完了した。

ヒトiPSC由来感覚ニューロンおよびヒトiPSC由来シュワン細胞をMEAプレート上で共培養し、対照として感覚ニューロン単独培養も実施した。被験物質または陰性対照を添加し、添加直後と6時間後に細胞外活動電位を計測した。被験物質は複数濃度を順次累積添加し、ラスタープロット、発火頻度の経時変化を解析した。予備検討では一部の被験物質では濃度依存的な変化は観察されなかったため、濃度依存的な変化が確認された被験物質について本試験を実施した。本試験実施後、RNAを抽出してRNA-seq解析を実施し、目的遺伝子の発現解析により被験物質の影響を評価した。

ヒトiPS細胞由来ドーパミンニューロンおよびアストロサイトをMEAプレートで共培養後、被験物質4種、陽性対照8種、陰性対照2種（計14化合物）について神経活動データを多変量解析およびAI解析により分析し、ドーパミンニューロンに対する被験物質の神経活性および依存性を評価した。算出した電気生理学的パラメータを用いた主成分分析により、一部の被験物質では毒性リスクが検出されたが、低濃度で神経活性化され、かつ高濃度の毒性リスクも低い被験物質が存在することが確認された。さらに作成したラスタープロット画像からAI による神経活性効果の予測を実施し、被験物質の作用機序について既知化合物より類推した。また、被験物質添加前後の培養上清について、ELISAによりドーパミン量を測定し、MEAの結果を補足した。

ヒトiPSC由来感覚ニューロンをMEAプレートで培養し、高速液体クロマトグラフィーで分画した被験物質画分を添加して電気活動を測定した。発火頻度の最も大きな変化のあった分画をさらに分画して同様の刺激試験を実施し、最も発火頻度の高い分画を特定した。発火頻度の算出区間を変更して再解析したところ、有意な増加が確認され、再現性についても問題ないことが示された。

Candida albicansおよびAspergillus fumigatusを対象に、CLSI M27Ed4またはM38Ed3に基づき、3種類の被験物質について薬剤感受性を受託評価した。各菌種の試験菌液を規定濃度に調製し、薬剤添加後、培養して発育阻止を目視で判定し、最小発育阻止濃度（MIC）または最小有効濃度（MEC）を決定した。これらの結果から、両方の菌株に対する抗菌作用を有する被験物質が判明し、各被験物質の作用特性に応じた発育阻止・顆粒状発育が確認された。

本試験は、ヒトiPS細胞へのBACプラスミド導入条件を体系的に検討し、スケールアップへ適用したものである。まず、至適G418濃度を段階検討し、150 µg/mLを選定した。 次に、Neonシステムを用いたエレクトロポレーション46条件（荷電23条件×DNA量2条件）と、リポフェクション4条件（試薬濃度2条件×DNA量2条件）を比較検討した。 エレクトロポレーションでは多くの条件で細胞が死滅し、未分化性の維持も困難であったのに対し、リポフェクション試薬が低濃度の条件ではG418耐性のコロニー形成を確認した。 これらの結果から、導入方法はリポフェクション試薬を低濃度とし、DNA量2条件を採用した。 その後、100 mmディッシュへスケールアップしてBACプラスミドを導入し、G418選別により複数の生存細胞を得た。

委託者提供の資料を基に、指定化合物の合成を行った。
原料1及び原料2は特許を参考に、5工程及び3工程で合成した。また、原料1と原料2を塩基性条件下で反応させて、指定化合物を合成した。

指定の低分子化合物の合成とエステル化を行った。

参考文献より、アミノアルコールの合成ルートの探索及び合成 (50g) を行った。

FTE契約にて、アゾール化合物の合成を行った。
スケールアップを念頭に置いた合成方法の検討も行った。

委託者提供の資料を基にRAFT重合による共重合体の合成を実施した。そして、スケールアップ条件を検討した。

7-ACA誘導体を3化合物合成した。合成方法の探索及び検討も実施した。

製造工程において、条件や機械操作など複数パラメータが品質に与える影響を解析した。製造時のログデータと品証データを統合し、Pythonによる機械学習を適用して相関度の高い変数を抽出。クラスタリングや次元削減を検討し、品質項目と工程パラメータの関係性を明確化した。さらに、予測アルゴリズムを開発し、工程中のパラメータ変更による品質改善の可能性を提示した。データ駆動型アプローチが製造プロセスの精度向上と不良率低減に有効であることを確認した。

製品の設計目標に見合う複数の要求特性を満たす材料の有無について、有機材料、無機材料を問わず広く調査した。既存製品や開発品についてはメーカより情報収集を行うとともに、技術文献（論文、国内・海外出願特許）より技術的に可能であるかの調査を行った。調査当時に入手できる材料（見込みを含む）では全ての特性を満足することは叶わなかったものの、有望ないくつかの研究開発情報があったため、その研究機関と技術情報を報告した。

高分子材料から極微量の溶出物があり規格NG。その溶出物を特定したいものの、委託者は高分子材料についての知見が少ないため苦労されていた。そこで、高分子材料の材料配合や製造プロセスに関する豊富な知見と、技術情報調査の結果から、溶出物の候補をリストアップし、効果的な分析手法を提案した。外部分析機関に分析の協力を仰ぎ溶出物を特定し、その結果より溶出物の混入ルートを特定できた。

ある成形品の３Dプリンティングに関する海外の研究開発動向について、公開情報、論文、特許などを調査し、進捗状況、課題、材料やプロセスの特徴について報告書にまとめた。

調査対象となる素材に関する研究を実施している研究機関がこれまでに獲得した公的研究資金を調査することで、研究動向について検討した。

競合他社の登録特許に対して異議申立対応を行うための情報収集を目的として、先行文献や先願特許を調査した。

依頼者の製品である蛍光物質の診断薬への応用を目的として、既存診断薬との直接・間接的性能比較による自社製蛍光物質の優位性の担保、抗体分子への化学修飾法について検討した。

固定化触媒を用いた精密フロー合成おいて、触媒の種類、反応式、反応スケール、装置等に関する情報を論文から調査した。

酸化金属表面に有機化合物を固定するための方法について文献を調査した。

医薬品成分の安定化剤の種類、処方、保存安定性試験データを特許実施例から収集した。

工業用アフィニティークロマトグラフィーの担体の種類およびリガンドの固定化方法について文献調査を行った。

乳酸菌の新規培養法に関する特許出願に際し、出願技術の新規性・進歩性を証明するために、既存の乳酸菌培養法に関する文献・特許調査を行った。

委託者のシーズ技術であるパッキン技術の異分野へ転用検討の一環として、異分野におけるパッキン技術の適用事例や開発動向に関する情報を収集するために、文献・特許を調査した。

ハムスター皮脂腺細胞を用い、24ウェルで前培養後に各3ウェルで無処理、hEGF 10 ng/mL、インスリン 10 nM、被験物質A～D（各5 mg/mL）を6日間作用させ、オイルレッドO染色による脂肪滴の評価を行った。陽性対照での成立性を確認しつつ、被験物質A、C、D、Bの順で皮脂合成促進傾向を確認した。

正常ヒト表皮メラノサイトに被験物質を添加し、7日後の形態、増殖能、メラニン産生を評価した。形態は顕微鏡撮影で観察し、増殖能はCellTiter‑Gloの発光強度を用いて統計解析した。メラニンはNaOH溶出後に吸光度測定し、検量線から算出した。6 nMの被験物質を添加したものでは細長い形態と膜破損が見られ、増殖能は未添加より有意に低下した。1.5および3 nMではデンドライトを有する細胞が増え、増殖能は未添加と同程度であった。メラニン総量は各濃度で未添加と有意差はなかった。陽性対照のα‑MSHおよびET‑1では、増殖能の上昇とメラニン増加を示した。以上から、被験物質は高濃度で増殖能を低下させ、低濃度でメラニン産生量の多い細胞を誘導する可能性が示唆された。

HepG2細胞で14種の化合物の一次スクリーニングを実施し、オレイン酸誘導トリグリセリド産生に対する抑制効果を評価した。評価はTriglyceride‑Glo Assayを改変して実施し、化学発光のカイネティック測定で定量した。最も強い抑制を示したのは化合物Aで、陽性対照を下回った。他の5種類の化合物は陽性対照と同等の抑制を示した。CCK‑8による同条件の測定では形態異常を伴う細胞障害性を認めず、化合物Aの吸光上昇はWST‑8還元への直接作用が示唆された。以上より、6種類の化合物は強い細胞障害性なくトリグリセリド産生を抑制すると判断した。今後は候補化合物でIC50算出を予定した。

予測ツールを検証するため、予測値と実測値の差と様々なディスクリプターの関連性を調査する。
調査のためには、公的データベースから取得可能なすべてのディスクリプターを取得する必要があるが、データベースごとにデータ形式が異なり、数値データや記述データを抽出する作業が煩雑になっているため、これらを整理して可視化する。

NGS解析を委託して得たデータを用いて、クラスタリング等の二次解析・可視化を行う。

Tet誘導発現システムを搭載したKnock-in donor plasmidを構築し、標的細胞のAAVS1領域（PPP1R12C遺伝子）への導入を実施した。Doxycycline添加による誘導発現の最適条件を検討し、0.1µg/mLが至適濃度と判断された。導入後の細胞において、蛍光タンパク質の発現を確認し、誘導発現の有効性を評価した。さらに、Puromycin耐性選抜を通じて、標的部位への正確な挿入と発現構造の安定性について解析を行った。

試験委託者が長期保存しているコラーゲン溶液中に発生した凝集体の発生原因を解明するため、試験委託者提供の2種類のコラーゲンについて、3種類の条件でコラーゲン溶液を調製した。コントロールとして、無処理のコラーゲン溶液を調製し、比較対照とした。約3週間の保存期間中、経時的に各コラーゲン溶液を観察した結果、3種類の条件下では凝集体は観察されなかった。以上のことから、凝集体の発生原因は、設定した3種類の条件由来ではないことが示唆された。

目的遺伝子の転写物（キャップおよびポリAテール付き）を、in vitro転写をベースに調製した。その後、蛍光物質を共有結合させ、蛍光標識mRNAを調製した。蛍光標識数は、蛍光強度測定値に基づき、RNA1分子当り平均81.0個のであると算出された。

線虫（Caenorhabditis elegans）に各種被験物質を添加し、寿命および体長への影響を評価した。コントロールと比較して、被験物質AおよびBでは平均生存日数がそれぞれ1日以上延長し、生存曲線でも有意差を示した（p < 0.05、Log-rank検定）。体長は各群で5〜10日または13日まで増加後に減少する傾向があり、被験物質Bでは最大体長到達までの成長速度が速く、その後の縮小がコントロールより遅かった。被験物質Aでも縮小の遅延傾向を示した。以上より、特定の被験物質が線虫の寿命延長に寄与し、体長維持に影響する可能性が示された。

鶏卵（10日卵）を用いてインフルエンザウイルスを調製した。孵化卵の検卵と洗浄後にウイルスを接種し、37℃で静置後に血管状態に基づき選別した。漿尿液を安全キャビネット内で回収し、-80℃で保存した。各ウイルス液のウイルス量は、HAアッセイ（Hemagglutination Assay）により評価した。

ヒトiPSC腸管上皮細胞を被験物質（3濃度）で刺激し、回収した培養上清をヒトiPSC感覚ニューロンへ添加して、MEA計測で活動電位の変化を記録した。濃度AおよびBでは陽性対照アセチルコリンを上回る上昇を示し、濃度Cでは同程度であった。RNA-seqにより腸管上皮における関連タンパク質の発現変化を確認し、感覚ニューロンでの特定遺伝子の発現を把握した。統計解析はHolm法およびDunnett法で実施した。

ヒト皮膚の共焦点顕微鏡画像を対象に、角層厚みの高精度測定を実施した。画像は三次元構造を保持したまま、位置ずれ補正（SIFT、RVSSなど）と輝度解析を組み合わせ、Z軸断面の再構築を行った。PythonとFiji/ImageJを活用し、前処理からアライメント、輝度分布解析までを自動化する一括実行スクリプトを構築した。輝度値で皮膚層を特定・算出し、全ディレクトリの測定を完了した。皮膚組織の構造評価における再現性と効率性を大幅に向上させ、化粧品・医療分野での応用可能性を示した。

複数ドナー由来のシングルセルRNAシーケンスデータを対象に、SNP情報を用いたドナー分別解析を実施した。1000 Genomesデータベースから抽出した高頻度SNPを活用し、Cellsnp-liteとVireoを組み合わせて遺伝子型推定を行った。約2万細胞を対象にドナー識別を行い、各ドナーの割合を算出するとともに、代表的なSNPを抽出し、Seuratとヒートマップで視覚化した。ドナー分別の精度検証と代表的SNPの同定により、混合サンプルの正確なドナー構成把握に貢献した。

PS細胞由来神経細胞に対し、アデノ随伴ウイルス（AAV）で遺伝子Aを強制発現させ、神経突起長を画像解析により定量評価した。タンパク質Bをコーティングした条件と非コーティング条件を設け、空ベクターを対照とした。AAVは添加濃度依存的に平均神経突起長を増加させ、1×10^9 vg/wellで有意な伸長を示した。タンパク質B存在下でも、1×10^9 vg/wellで非存在・空ベクター条件と同等以上の伸長を示した。統計解析は等分散性確認後にTukey‑Kramer法で群間比較を行った。本結果は、遺伝子Aがタンパク質Bによる突起伸長阻害を抑制し得る可能性を示す。

SEM画像を対象に、スケールバー計測に基づいて実測スケールを設定し、ノイズ低減や局所コントラスト補正などの前処理を行った後、H‑Watershed による粒子分節化を実施した。画像条件に応じてパラメータを調整し、過分割・未分割の発生を抑制したうえで、Feret径、面積、真円度などの特徴量を抽出し、ヒストグラムや散布図による粒子径分布・形状傾向を評価した。
解析は ImageJ/Fiji を中核として進め、必要に応じて手動修正を加えながら中間報告で品質確認を行った。再解析や新規データへの展開を見据え、環境構築手順、マクロ、パラメータ設定、作業手順を一式として整備し、測定の一貫性と再現性を確保した。

3次元表皮モデルに被験物質で前処理後、界面活性剤で炎症を誘導し、IL 1α、IL 6、IL 8、TNF α等の炎症関連遺伝子と、filaggrin、claudin 1、loricrin等のバリア関連遺伝子の発現をqRT PCRで定量した。界面活性剤添加でIL 1αおよびIL 8が上昇し、被験物質による発現抑制は認めなかった。IL 6は検出感度以下、TNF αは一部群でのみ検出であった。バリア関連では、被験物質Aでfilaggrinとloricrinが低下し、被験物質Bでfilaggrin上昇傾向、被験物質Cでclaudin 1上昇傾向を示した。炎症抑制は限定的であったが、バリア機能への影響評価を再現性ある手順で実施した。

3次元表皮モデルに被験物質で24時間前処理後、大気汚染物質（50/100/200 µg/mL、0.1% DMSO）を添加し、IL 1α、IL 1RA、IL 8の発現をReal Time PCR（RT-qPCR）で定量した（n=3）｡ 大気汚染物質単独では濃度依存的な発現誘導は認められず、前処理時に一部サイトカインで上昇傾向が見られた｡ IL 1αは被験物質A＋ 50 µg/mL大気汚染物質で最も高く、IL 8は被験物質Aおよび被験物質Bで増加傾向を示した｡ IL 1RAは被験物質A＋ 50 µg/mL大気汚染物質で上昇傾向が確認され、IL 1RA/IL 1α比は大気汚染物質単独で低下、被験物質A＋100 µg/mL大気汚染物質のみ未添加より大きい値となった｡

化合物スクリーニングにおける高精度なデータ解析を目的とし、複数の測定機器から取得した生データを統合処理するシステムを開発した。フォーマット設計、ブランク補正、正規化、外れ値除外などの解析機能を実装した。さらに、シグモイド曲線の自動フィットや描画、主要な用量応答指標（半最大効果濃度、最大効果など）算出などに対応した。試験データの再現性と信頼性を確保し、スクリーニング業務の効率化と標準化を実現した。

食品化合物データベースから標的タンパク質に結合する可能性を持つ化合物を選定し、分子動力学（MD）シミュレーションで安定性を評価した。まず、ドッキングスコアや構造類似性を基に数10～100程度の化合物を抽出し、標的タンパク質との複合体構造を作成。数ナノ秒規模のMD計算で、タンパク質・リガンドのRMSD変化と結合自由エネルギー（MM-PBSA法）を解析した。結果として、構造変化が小さく、結合自由エネルギーが高い化合物を有望候補として選定した。さらに、機械学習モデルから経口吸収されやすい化合物を予測・選択した。MDシミュレーション由来の化合物とドッキングシミュレーション由来の化合物を合わせて有望候補化合物とした。食品由来成分の創薬応用に向けた科学的根拠を提示し、効率的なバーチャルスクリーニング手法の有用性を示した。

標的タンパク質間の相互作用を阻害する食品由来化合物を探索するため、バーチャルスクリーニングと分子動力学（MD）シミュレーションを実施した。食品化合物データベースから分子量や構造条件を満たす数1000規模の化合物を対象に、AutoDock Vinaを用いて標的タンパク質のドメイン構造へのドッキング解析を行い、結合自由エネルギーに基づき候補化合物を選定した。さらに、数ナノ秒規模のMDシミュレーションで複合体の安定性を評価し、RMSD変化が小さい化合物を最終候補として提案した。オートファジー促進や細胞老化制御に寄与する可能性を持つ食品化合物の有望な阻害候補を提示した

既に確立された酵素の化学発光反応系を用い、提供された化合物について、60種類の酵素を個別に1536-well plate上で反応させ、その化学発光をプレートリーダーにて測定した。測定データ (プレート 16枚分) を提出した。

哺乳類細胞において、指定の guide RNA 配列および Cas9 タンパク質を発現させる All-in-one 型プラスミドベクターを3種類、設計・作製し、提出した。

提供いただいた436個の尿検体について、9種類の ELISA キットを用いて、標的タンパク質の濃度を定量した。

陽性対照となる細胞を用いたウエスタンブロットを行い、標的遺伝子産物に対する複数種類の抗体から、機能的なものを選別した。siRNAを導入した細胞において、選択した抗体を用いたウエスタンブロットを行い、siRNAによる遺伝子発現抑制を評価した。

タンパク質A-核酸Bの相互作用をHTRFにより測定するアッセイ系を用いて、提供された40万種類の化合物 (1536-well plateに分注済み) の相互作用阻害能を検討するため、それらの存在下でHTRFの測定を行った。

提供いただいた被験物質に対する線虫の走化性並びに活動性を撮影した動画を解析し、評価した。

哺乳類細胞において、目的遺伝子AおよびBを同時に共発現させるプラスミドベクターを構築した。そして、トランスフェクション用のプラスミド調製を行い提出した。

標的遺伝子に対するguideRNAとCas9を発現するレンチウイルスベクターを調製した。そして、提供いただいた細胞に感染させ、感染が成立した細胞を薬剤により選択した。

標的遺伝子に対するguideRNAを3種類設計し、それぞれの切断効率を培養細胞を用いて評価し、最も切断効率の高いguide RNAを選択した。その guide RNAとCas9を共発現するプラスミドベクターを構築した。

4種類の導入試薬を用いて、各種条件で細胞株に核酸を導入した。導入24、48時間後に細胞からRNAを抽出し、標的遺伝子Aおよび内部標準遺伝子Bの発現量をリアルタイムPCR (qPCR) で定量的に評価した。

ヒト線維芽細胞からRNAを抽出し、6種類の標的遺伝子の発現量をリアルタイムPCR (qPCR) で評価した。

委託者より提供された陽性対照となる細胞からタンパク質抽出液を調製した。そして、抗体Aおよび抗体B並びにβ-アクチンに対する抗体を用いたウエスタンブロットを行い、標的タンパク質が検出されるか否かを確認した。

標的遺伝子に対するリアルタイムPCR (SYBR Green I) 用のプライマーを設計した。リアルタイムPCR (qPCR) により、提供いただいたRNA中の標的遺伝子の発現量をβ-アクチンに対する相対発現量として定量的に評価した。

提供いただいた3種類のプラスミドについて、それぞれトランスフェクショングレードにて2mg以上調製し、提出した。

CHO系細胞を用いて3種類の組換え抗体の発現条件の検討を行った。そして、細胞培養上清中の組換え抗体の状態を還元/非還元のSDS-PAGE により解析した。

植物AのマイクロRNAをPCR増幅後にプラスミドへ挿入し、miRNA発現プラスミドを構築した。マイクロRNAの標的配列を合成後、ルシフェラーゼ発現プラスミドに挿入し、レポータープラスミドを調製した。

CHO系細胞にHis-tag標識されたタンパク質Aを一過性発現させ、培養上清からTALONレジンによりタンパク質Aをアフィニティー精製した。そして、タンパク質Aに対する抗体を用いたウエスタンブロット解析を行い、精製物が抗体によって認識されることを確認した。

哺乳類細胞において、N末端側にFLAG配列を付加した目的遺伝子を発現するプラスミドベクターを構築した。その後、プラスミドをMini-prepレベルで調製した。

目的遺伝子を哺乳類細胞において発現させるプラスミドベクターを構築した。それをヒト大腸がん細胞株へリポフェクションにより導入し、薬剤耐性となった細胞をクローン化した。クローン細胞において、目的遺伝子の発現をリアルタイムPCR (qPCR) により測定し、発現量の高かった5クローンを提出した。

提供いただいた3種類の培養プレート上で哺乳類細胞を培養した。2種類の増殖阻害剤をそれぞれ、段階希釈して添加し、その後の細胞増殖をMTSアッセイで評価した。

2種類の浮遊系細胞について、エレクトロポーレーションによる遺伝子導入の検討、ならびに、選択薬剤の至適濃度の検討を行った。そして、最適化された条件でプラスミドベクターを導入後、薬剤選択を行い、薬剤耐性を示し、プラスミドが安定導入された細胞を提出した。

正常ヒト新生児表皮角化細胞に対して、被験物質存在下で紫外線 (UVB) を照射し、生成される活性酸素種 (ROS) の量をDCFDA/H2DCFDA-Cellular ROS Assay Kitを用いて評価した。

正常ヒト新生児表皮角化細胞に対して、被験物質存在下で過酸化水素を添加し、産生されるIL-1αの量をELISAにて評価した。

正常ヒト新生児表皮角化細胞に対して、被験物質存在下で紫外線 (UVB) を照射し、一酸化窒素 (NO) の量をQuantiChrom Nitric Oxide Assay Kit を用いて評価した。

正常ヒト新生児表皮角化細胞に対して、被験物質存在下で紫外線 (UVB) を照射し、IL-1αの産生量をELISAにて評価した。

200検体に含まれるタンパク質Aの濃度をELISAを用いて測定した。

タンパク質A-タンパク質Bの結合をHTRFにより測定するアッセイ系を用いて、7種類の化合物の結合活性に与える影響を評価した。

5種類の被験物質をヒト乳がん細胞株に添加し、WSTアッセイを行い、被験物質の細胞増殖に与える影響を評価した。また、マイクロアレイによる発現解析を行うため、被験物質を添加した細胞からRNAを抽出、精製した。

提供された細胞に3種類のプラスミドをそれぞれ、リポフェクションにより導入した。その後、細胞を回収し、ホルマリン固定を行い、提出した。

提供いただいた特殊な細胞に12種類のレンチウイルベクターをそれぞれ感染させ、薬剤選択を行い、薬剤耐性となった感染細胞の凍結ストックを調製し、提出した。

PCRにより調製した2本鎖DNAと提供いただいた物質を指定の条件で反応させ、その反応産物をPAGEにより解析した。

提供いただいた核酸類縁体を各種濃度の核酸分解酵素で処理し、その後、HPLCにより分解の程度を解析した。

提供いただいた細胞を拡大培養し、凍結ストック (>1x10^6 cells/vial x 14本) を調製した。

4種類の菌類を培養し、加熱により不活性化後、指定の菌濃度に調製し、提出した。

化粧品素材を表皮角化細胞に添加した際の細胞生存率を調べ、細胞傷害性を評価した。

培養細胞に被験物質を添加し、分泌された副腎皮質ホルモンをELISAにて測定した。

被験物質が筋肉の発達・成長に及ぼす効果を検討するために、C2C12細胞の分化におけるエネルギー産生関連遺伝子の発現量を調べた。

アルコール代謝の関連酵素を用いて酵素活性を指標にした被験物質のスクリーニングを実施した。

食欲抑制に関わる因子の作用機序を調査しレビューを作成した。

血液から細胞を分離後、被験物質を添加して一定期間培養し、ELISAにてサイトカインを測定した。

培養細胞に植物エキスを添加し、ストレス関連ホルモン受容体のmRNA発現量をリアルタイムPCR (qPCR) にて評価した。

cDNA 230種についてSYBR Green I を用いたインターカレーション法にて計3,720検体のリアルタイムPCR (qPCR) を実施した。

変形性関節症の関連酵素に対する阻害剤の評価 (IC50の算出) を行った。

SDS-PAGEによる補体活性評価系を構築し、活性化阻害剤の評価 (IC50の算出) を行った。

培養細胞にて脂肪蓄積を誘導し、蓄積に対する阻害剤の評価 (IC50の算出) を行った。

マウスに被験物質を経口投与した後、肝臓中のアルコール代謝関連酵素の活性を測定した。

細胞培養上清中に含まれるサイトカインをメンブレン抗体アレイ及びELISAにて評価した。

血漿中の血圧降下関連因子をELISAにて測定した。

培養細胞を用い、siRNAによる標的遺伝子のノックダウンを行い、関連遺伝子のmRNA量をqPCR (TaqMan法) にて評価した。

植物エキスの抗酸化能を評価し (Trolox等価活性)、抗菌作用 (IC50) を評価した。

細胞6種に対し標的遺伝子をアンチセンスオリゴによりノックダウンし、ノックダウンによる影響を細胞生存率、アポトーシス及び関連遺伝子の発現量 (qPCRによる測定) を調べることで評価した。

癌細胞株にレポータープラスミドを導入しプロモーターアッセイ系を構築した後、約300種の被験物質について、プロモーター活性への影響を評価した。

開発素材の触り心地についてモニターを募集し、触感に関するワードにて評価軸を設定し官能評価を実施した。

血液から血清を調製しELISAにてステロイドホルモンを測定した。

関節炎に関連して、軟骨細胞におけるII型コラーゲン及び滑膜細胞における炎症性サイトカイン (IL-6、TNFα) をELISAにて定量した。

ルシフェラーゼを発現するレポーター細胞を用いて、開発素材の細胞への効果を定量的に評価した。

癌細胞株に化合物を作用させ、通常培養条件下と低酸素培養条件下で細胞増殖を比較した。また、培養上清中の低分子化合物をHPLCにより測定した。

分泌タンパク質AのStrepタグ融合タンパク質を哺乳類浮遊細胞で発現させ、培養上清からStrepTactinアフィニティー精製を行った。

ウイルスがコードする酵素のFLAGタグ融合タンパク質を哺乳類浮遊細胞で発現させ、アフィニティー精製を行った。精製された酵素の活性を測定し、活性が保持された高純度の酵素が精製されたことを示した。

ヒトの酵素のFLAGタグ融合タンパク質を哺乳類浮遊細胞で発現させ、アフィニティー精製を行った。

ご提供頂いた細胞溶解液5種を用いて、FLAGタグ融合タンパク質のアフィニティー精製を行った。

FLAGタグあるいはGST融合タンパク質6種について、哺乳類浮遊細胞1 Lスケールで発現させ、アフィニティー精製を行った。

ヒト酵素のHisタグ付きタンパク質を哺乳類細胞で発現させるプラスミドベクターを構築した。構築したプラスミドを哺乳類浮遊細胞に導入し、目的タンパク質の産生条件を検討した。さらに、目的タンパク質のアフィニティー精製条件を検討した。

ヒト酵素のHisタグ付きタンパク質を哺乳類浮遊細胞で発現させ、2 L培養分の細胞を用いて、大量精製を行った。

試験委託者よりご提供いただいたハイブリドーマの拡大培養・凍結ストックの作製を行った。また、培養上清150 mLを用いて、Protein Gセファロースにより、抗体を精製した。

試験委託者よりご提供いただいた、20種のハイブリドーマ培養上清１Lずつから、Protein AセファロースあるいはProtein Gセファロースを用いて、抗体の精製・透析・濃縮を行い、納品した。

増殖因子刺激によるERKリン酸化を検出するアッセイ系を確立するために、AlphaLISAキットを用いて増殖因子量依存的リン酸化の検討を行った。

増殖因子刺激による受容体チロシンキナーゼの二量体化を検出するアッセイ系を確立するために、化学発光検出キットを用いて増殖因子量依存性を検討した。

増殖因子による遺伝子発現誘導を検出するアッセイ系を確立するために、レポーターアッセイにより増殖因子量依存性を検討した。

増殖因子刺激によるヒト表皮角化細胞株のヒアルロン酸産生アッセイ系を確立するために、ELISAにより増殖因子量依存性を検討した。

増殖因子刺激によるヒト表皮角化細胞株の細胞増殖アッセイ系を確立するために、WST-8により増殖因子量依存性を検討した。

被験物質が毛乳頭細胞を活性化する効果を持つかを検討するために、ヒト頭髪由来の毛乳頭細胞で細胞増殖や増殖因子の産生を測定した。

被験物質が血管機能改善効果を示す可能性があるか検討するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞のNO産生やサイトカイン産生に与える影響を検討した。

抗癌剤の候補化合物が、癌細胞株の翻訳開始因子の複合体形成に影響を与えるかを、プルダウンアッセイにより検討した。

抗癌剤の候補化合物が、癌細胞株の増殖に与える影響を検討した。

ヒト線維芽細胞の初代培養を用い、各種刺激によるAkt、Stat3、Stat6のリン酸化を、各リン酸化タンパク質特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。

ヒト線維芽細胞の初代培養を用い、IL-4刺激によるターゲットタンパク質のリン酸化を、各リン酸化タンパク質特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。

癌細胞株を、10枚のT-225フラスコに拡大培養し、無血清培地に置換後2日間培養し、培養上清を回収・清澄化し、提出した。

ご提供頂いた哺乳類細胞をCO2濃度8%下で振とう培養し、凍結細胞ストックの作製、および1 Lの培養上清の調製を行った。

酵母の培養における、各種培地や環境の条件を最適化するため、20条件に付いて、細胞密度、酸素濃度、pH、分泌ペプチドの測定を経時的に10時間ずつ行った。

抗癌剤の候補物質が、癌細胞株のミトコンドリア機能に与える影響を検討するために、ミトコンドリア構成タンパク質3種の発現をスウエスタンブロットにより検出した。

ご提供頂いた細胞溶解液のタンパク質濃度を測定し、一定量のタンパク質溶液について6種類の抗体でウエスタンブロットを実施し、各タンパク質の産生量を比較検討した。

ご提供ただいた組織サンプルを可溶化し、タンパク質濃度を測定した。一定量のタンパク質溶液について、抗JNK抗体と抗リン酸化抗体によるウエスタンブロッティングを行い、JNKのリン酸化レベルを比較した。

各種核酸保存試薬、核酸保存製品、分子生物学研究用酵素の性能を市販品と比較評価した。

PCR装置の新製品の評価を行うために、連続ランによる安定性や気密性の確認を行った。

分子生物学研究用製品のヌクレアーゼフリーを検証するために、DNaseおよびRNaseの活性を測定した。

被験物質が光刺激依存的な神経活動に与える影響を検討するために、マウスから生体切片を調製し、微小電極アレイ法のより神経細胞の活動を測定した。

核酸医薬品候補の血清中安定性、in vitro培養系でのノックダウン(KD)効率、in vivoサンプルでのKD効率をreal-time PCR (qPCR) により評価した。加えて、安定発現細胞株の作製、in vitro translationなども行った。

3種類のHLAタンパク質を発現する発現ベクターを構築し、ヒト癌細胞株にトランスフェクションして安定発現細胞株を樹立した。目的タンパク質の発現を、共焦点レーザー顕微鏡とフローサイトメーターにより確認し、シングルクローン化した。

マウスの大腿筋にエレクトロポレーション法によりDNAワクチンを接種した。

新たなPCR装置開発のため、PCR反応前後で溶液物性が変化する反応条件を検討した。

天然物からの抽出物をハムスター皮脂腺細胞に添加し、皮脂合成能および細胞増殖能を評価した。

麹菌を培養し、培養液を熱処理して菌を死滅させた。調製した死菌サンプルを提出した。

菌培養液に含まれるオリゴ糖の精製条件を検討した。最終的に100 gスケールでの精製から目的物を数十g得た。

幾つかの変異を含むタンパク質に既存医薬品を添加し、限外ろ過を利用して、未結合医薬品を回収し、HPLCで定量した。

果実種子の種皮と胚乳部分を分離し、抽出後、LC-MSを用いて、生理活性成分を定量した。

果実種子由来の生理活性化合物の抽出及び精製条件を検討し、化学分析に必要な数十mgを精製した。

沈殿法による漢方薬に含まれる低分子化合物の分離法を検討した。

特殊加工されたフィルム表面のみに菌液を滞留させ、一昼夜後の菌体濃度を測定して殺菌能力を評価した。

植物由来のトリグリセリドの精製のための効率的なクロロフィル除去方法を検討し、効果的な方法を発見した。

食品添加物規格に準じた植物由来トリグリセリドの精製法を確立した。

植物由来のトリグリセリドをHPLC純度95％以上で精製した。

ウイルスデバイスを創成するための検出方法に関する調査を行った。

ヒト及び他哺乳類の酵素Aについて複数の基質を用いた場合の阻害活性評価系を構築した。構築した評価系を用いて、9種類の化合物について阻害能を評価した。

タンパク質へのコンジュゲーションを目的として既知薬剤にマレイミド基を導入した化合物を合成した。

オカラ培地の抽出及び低分子化合物の精製を行い、目的化合物を数十mg得た。

ある食品に含まれる特定のポリフェノールを数種類、数十mg精製し、提出した。

合成した脂質結合型カテキン類を用いて、ある食品抽出液中の該当化合物の定性及び定量試験を実施した。

1L小型ジャーファーメンターを用いて、数種類の培養液での培養、発酵状況を検討した。培養、発酵状況は、HPLC等を利用して栄養素、発酵産物を定量データから評価した。

分子量の異なるタンパク質混合溶液を用いて、提供いただいた開発中の中空糸膜のろ過性能評価を実施した。一定時間間隔でろ液を回収し、ろ液量からろ加速度を評価した。またろ液をSDS-PAGEで分析し、限外ろ過能を評価した。